基于SSR标记的68份红毛丹种质资源DNA指纹图谱构建

林兴娥 牛俊海 陈莹 明建鸿 高宏茂 葛宇 周兆禧

摘  要  本研究利用筛选出的10对多态性高、条带清晰的SSR引物，以海南岛68份红毛丹种质为材料，进行遗传多样性分析和SSR指纹图谱的构建。结果表明：10对引物在供试材料中共检测出20个等位位点，多态性条带比例为100%，平均多态性信息含量（PIC）为0.393;对68份红毛丹种质做聚类分析，遗传相似系数为0.290～0.664;采用引物-带型组合法构建了68份红毛丹种质的指纹图谱。该结果为今后红毛丹种质鉴定和分子育种提供重要依据。

关键词  红毛丹;SSR;DNA指纹图谱中图分类号  S667.9      文献标识码  A

Abstract  The SSR fingerprint map and genetic diversity of 68 rambutan （Nephelium lappaceum L.） accessions were studied using 10 pairs of selected polymorphic SSR primers. The results indicated that all the primers showed polymorphism， and 20 polymorphic alleles were revealed and the average polymorphic information content （PIC） was 0.393. The genetic similarities among accessions ranged from 0.290 to 0.664， on which a phylogenetic tree showing the relationship among the accessions was constructed. A strategy of combining primer pair with distinct alleles for fingerprint construction was developed and applied to the 68 cultivars. The DNA fingerprinting provides a technical reference for the varieties identification and molecular breeding in rambutan.

Keywords  Nephelium lappaceum L.; SSR; DNA fingerprint

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.013

紅毛丹（Nephelium lappaceum L.）为无患子科（Sapindaceae）韶子属（Nephelium）热带多年生常绿乔木植物，起源于印度尼西亚和马来半岛，别名毛荔枝，与荔枝、龙眼同科。海南保亭热带作物研究所（以下简称保亭热作所）自1960年从马来西亚引进我国试种，并在此基础上于20世纪80年代选育出适于海南省推广种植的‘保研系列品系。早期对红毛丹品系缺乏系统完善的鉴定方法，传统的形态学特征鉴定易受环境条件影响，且资源圃内种植年限长，植株高大，挂果率低，以株型、叶型、果型等农艺性状和果实性状为主的鉴定方法难以实行，致使品系混乱，限制了有针对性地开展本土化育种，严重制约了我国红毛丹产业规模化、可持续性发展。

与传统的形态学标记方法相比，分子标记技术具有简便、可靠、不受环境影响和多态性高等优势。已有国外研究报道分别应用RAPD[1-2]、AFLP[3]、ISSR和SRAP[4]等通用型的DNA分子标记技术，对部分红毛丹品系开展了分子鉴定、种质资源评价等研究。但由于红毛丹基因组及遗传标记信息的匮乏，基于物种特异性分子标记（如SSR）的资源鉴定与评价尚未见报道。本研究在已完成红毛丹Genome survey测序及全基因组范围内开发SSR分子标记的基础上，筛选出10对高多态性SSR引物，对在海南岛收集并保存的68份红毛丹种质资源进行遗传多样性分析，并开发了一种指纹图谱构建方法，为红毛丹种质资源的亲缘关系分析、品种鉴定和分子育种等提供科学依据。

1  材料与方法

1.1  材料

66份红毛丹材料采自保亭热作所红毛丹种质资源圃，2份材料采自儋州热带植物园，基本信息如表1所示，采集枝条上无病虫害的新鲜幼嫩叶片，液氮速冻后-80 ℃保存备用。

1.2  方法

1.2.1  红毛丹基因组DNA的提取及质量检测  采用改良2×CTAB法[5]提取红毛丹叶片基因组DNA。称取幼嫩叶片0.2 g，加入0.03 g PVP和液氮磨成细粉，然后转入2.0 mL预冷冻离心管中，再加入800 mL 65 ℃预热的CTAB提取液[2%（m/V）CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/ L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2%（m/V）PVP，pH调至8.0]和20 μL b-巯基乙醇充分混匀，65 ℃温浴30 min，期间轻摇2次;水浴完成后离心（15 ℃，12 000 r/min）15 min取上清液，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提上清液，颠倒使之充分混匀，离心（4 ℃，12 000 r/min）15 min 取上清;再加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提1次，颠倒混匀，离心（4 ℃，12 000 r/min）15 min 取上清;加入等体积的异丙醇，混匀后可见丝状或絮状沉淀，即为DNA粗提物，用70%乙醇洗涤3遍，吹干;加入100 μL超纯水溶解DNA，再加入0.5 μL RNase A液（10 mg/mL），37 ℃水浴消化30 min，最后用紫外分光光度法和1%琼脂糖凝胶电泳法检测样品DNA质量及完整性。根据检测结果，将总DNA稀释至20 ng/μL后，-20 ℃保存待用。

1.2.2  分子标记分析  SSR引物均由深圳华大基因科技有限公司合成。从前期开发的红毛丹SSR标记中随机挑选出50对引物，以果皮颜色、果实大小和口感差异大的6份红毛丹种质DNA（分别为BR2、BR5、R2、R10、R20、R60）为模板进行PCR扩增，最后筛选出10对扩增条带清晰、多态性高且重复性好的引物（表2），SSR-PCR体系为20 μL，包括：30 ng DNA模板、0.2 mmol/L dNTPs、1.2 μmol/L引物，2.0 mmol/L MgCl2和2.0 U Taq DNA聚合酶。10×buffer、MgCl2、Taq DNA聚合酶均购自Thermo Fisher Scientific公司。SSR-PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，每个循环降1 ℃，72 ℃延伸1 min，共进行6个循环;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共进行25个循环;72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。PCR产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分離，恒功率60 W电泳1 h，银染显带。

1.3  数据处理

根据电泳结果，在凝胶相同迁移率位置上，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，构成“0、1”序列数据阵，将图形资料转换为数字资料，采用Popgene 32软件进行多态性与特异性分析，使用NTSYS 2.0软件对种质进行UPGMA法聚类分析。DNA指纹图谱构建采用英文字母与数字组合的方式[6-7]，其中英文字母按照多态引物字母编号依次排列，数字表示该分子标记在某样品上扩增条带的分子量，按分子量从大到小的顺序进行记录，同一引物扩增得到的不同条带间用“-”连接数字，综合不同引物的分析结果，串联各带型编号，形成该品种的SSR指纹图谱。

2  结果与分析

2.1  SSR标记多态性分析

对68份红毛丹种质进行PCR扩增，共检测到20条多态性片段，平均每个标记2条，多态性条带比例为100%。由表3可知，20对SSR标记检测到的有效等位基因（Ne）平均值为1.730，变幅为1.133（RamSSR25）～1.996（RamSSR19）;每个标记的多态性信息含量（PIC）平均值为0.393，变幅为0.365（RamSSR13）～0.498（RamSSR19），由此可见，各品系间多态性较低。

2.2  指纹图谱的构建

构建DNA指纹图谱的基本原则是利用尽量少的标记区分尽量多的种质，以达到提高检测效率、降低成本的目的。综合考虑引物扩增的条带数、稳定性、条带清晰度、PIC值等因素，最少用7对SSR引物（RamSSR12、RamSSR13、RamSSR19、RamSSR25、RamSSR30、RamSSR31、RamSSR33）就可将68份红毛丹种质完全区分（表4，图1）。其中，RamSSR13检测效率最高，可鉴别28份红毛丹种质。

2.3  红毛丹种质资源的聚类分析

对68份红毛丹种质进行UPGMA法聚类分析，结果见图2。各品系间遗传相似系数平均值的变化范围为0.290～0.664，最小值变化范围为0～0.375，最大值的变化范围为0.572～1.000（表5）。由此可见，68份红毛丹种质间的平均遗传相似系数较低，整体上遗传多样性不高，但各种质间也有很明显的差异。ZWY2和BR2、R53，R24和R61遗传相似性系数均为0，说明ZWY2和BR2、R53，R24和R61遗传基础差异最大，R32和R34遗传相似系数为1，说明2个资源遗传基础相同，遗传来源接近。68份种质的聚类结果显示，在遗传相似系数为0.45处，所有品种可划分为4个类群，BR2为黄果实生苗，遗传基础和其他种质不同，每个类群又被分为几个亚群，总体遗传相似程度高，遗传多样性相对较低。

3  讨论

随着分子生物学和基因组测序技术的发展，越来越多的分子标记被开发应用于植物遗传研究，SSR标记与ISSR、SRAP、RAPD等通用性分子标记相比，具有数量丰富、共显性遗传、多态性丰富等优点，现已广泛应用于果树的品种鉴定、遗传多样性研究等领域。Anggraheni等[2]利用6个RAPD标记对9个红毛丹品种进行了遗传多样性分析，多态性分析结果显示，品种间的变异率为56%，PIC值为0.2～0.5。Kuswandi等[8]对收集到的33份红毛丹及其近缘种质进行了形态学指标调查，并对其遗传多样性做了聚类分析，结果表明，红毛丹及其近缘种分布在不同类群中，平均变异率约为55%。本研究中利用7对SSR引物对68份红毛丹种质的聚类结果显示，在遗传相似系数为0.45处，所有种质可划分为4个类群 ，每个类群又被分为几个亚群（BR2为黄果实生苗，遗传基础和其他种质不同）。遗传相似性分析显示，68份红毛丹种质之间遗传相似系数平均值变幅为0.290～0.664，总体的遗传相似性较小，遗传基础相对较窄。

DNA 指纹图谱有助于快速、准确地鉴定品种真实性和纯度，已广泛应用于多种作物的遗传育种和品种保护研究中。其中SSR标记具备可重复性好、操作简便、共显性等优点，被认定是分子指纹图谱构建的可靠标记类型之一。本研究采用SSR引物-带型组合法构建的指纹图谱，筛选出7对SSR引物（RamSSR12、RamSSR13、RamSSR19、RamSSR25、RamSSR30、RamSSR31、RamSSR33）PIC值范围为0.362～0.498，平均PIC为0.399，略高于油菜（0.36）、花生（0.36）等作物指纹图谱构建所用的核心引物的PIC值[9-10]，可将68份红毛丹种质完全区分。随着红毛丹种质收集数量的不断增加，需要不断筛选、增加引物，扩充指纹图谱数据库;同时，还可将形态学鉴定、同工酶遗传标记分析、染色体分析等技术结合起来，形成完整的红毛丹指纹图谱数据库，以保证指纹数据库的实用性和准确度。

本研究选用红毛丹种质资源大部分采自保亭热作所红毛丹种质资源圃，红毛丹种质均于20世纪60年代引自马来西亚等地区，由于年代久远，早期引种记录缺失，缺少配套栽培管理，导致红毛丹资源圃现有种质管理混乱，遗传基础不清晰，遗传多样性低。目前生产上主要种植‘保研7号为主的‘保研系列品种，由马来西亚种质选育，遗传基础相对狭窄，不仅果实商品类型不够丰富，也限制了遗传育种的潜力。因此，需要广泛收集和鉴定红毛丹种质资源，尤其是保护和挖掘本地的优异野生资源与开展品种改良工作，是扩大生产、降低风险、提高品质、促进我国红毛丹产业进一步发展的迫切需求。

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