SPF鸡和商品蛋鸡粪便菌群及大肠杆菌抗药性的比较分析

摘 要：通过粪菌移植可以调节肠道菌群的组成，已成为降低肠道菌群抗药性的方法之一，而筛选合适的粪菌移植供体尤为重要。本研究利用16S rRNA基因高通量测序技术分析了两种候选供体SPF鸡和商品蛋鸡在不同养殖模式下5个不同日龄粪便菌群的组成，并利用药物敏感性试验比较了粪便中大肠杆菌的抗药性水平。结果表明，两种蛋鸡粪便菌群的丰富度都表现出随日龄增加而增加的趋势，其中商品蛋鸡粪便菌群的种类更加丰富，而SPF鸡粪便菌群的组成更加均一。在门水平上，SPF鸡拥有更多的厚壁菌门细菌，而商品蛋鸡含有更多的变形菌门、拟杆菌门和放线菌门细菌。在属水平上，两种蛋鸡粪便中的优势菌均为乳酸杆菌属和埃希氏-志贺氏菌属，其中SPF鸡存在更多的乳酸菌属和隐秘杆菌属，而商品蛋鸡含有更多的拟杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、梭菌属、链球菌属和克雷伯菌属。药敏试验结果表明，SPF鸡粪便中大肠杆菌对抗生素的抗药率、多重抗药性比例和最低抑菌浓度（MIC）的频率分布均显著低于商品蛋鸡。该结果深入分析了两种养殖模式下不同日龄蛋鸡的粪便菌群，结合粪便中大肠杆菌抗药性水平的比较分析，进一步表明SPF鸡粪便菌群更加安全、敏感，可以作为粪菌移植的供体用于降低肠道菌群的抗药性。

关键词：SPF鸡；商品蛋鸡；粪便菌群；抗药性

家禽养殖业中抗生素的不合理使用加速了细菌抗药性的产生，这不仅降低了抗生素的药效，而且导致抗药菌在食物链的传播，危及食品安全和公共卫生[1]。此外，治疗特定病原菌的抗生素多为广谱抗生素，而广谱抗生素的使用同时会破坏宿主正常的肠道菌群，增加宿主患二次感染的风险[2]。因此家禽养殖业中迫切需要减少抗生素的使用、降低细菌抗药性。

过去15年左右，大量文献报道肠道菌群对宿主的健康存在重要影响[3，4]。粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是将健康者（供体）粪便菌群移植给患者（受体）以恢复其紊乱的肠道菌群的技术，多用于治疗肠道相关疾病，尤其是复发性艰难梭菌的感染[5，6]。有文献报道，在治愈患者复发性艰难梭菌感染的同时，粪菌移植降低了患者肠道内抗药基因的种类和丰度，而且减少了变形菌门细菌的丰度[7]。粪菌移植在降低艰难梭菌感染患者肠道细菌的抗药性上取得成功，考虑将粪菌移植应用到鸡身上，以期降低细菌抗药性，而粪菌移植实施的前提是选择良好的供体。

SPF鸡在封闭环境中养殖，不使用抗生素，饲喂无菌的饲料和水，且不携带特定病原体。而商品蛋鸡在开放式环境中养殖，在生长的某个阶段使用部分抗生素。两种鸡的养殖方式不同，这可能会对鸡的粪便菌群和抗药性产生影响。本研究中，利用16SrRNA基因高通量测序技术和药敏试验技术比较分析了SPF鸡和商品蛋鸡的粪便菌群结构及粪便中大肠杆菌的抗药性水平，以期为粪菌移植筛选合适的供体用于降低细菌抗药性的研究。

1 方法与材料

1.1 样品采集 选择采集鸡粪样品的SPF鸡场和商业蛋鸡场，分别位于济南市长清区和德州市齐河县。SPF鸡品种为白来航鸡，而商品蛋鸡为海兰褐。饲料依据国家标准配制。采集5个不同时间点的鸡的粪便，包括2周龄（育雏期）、19周龄（产蛋起始期）、25周龄（产蛋高峰期）、46周龄（减产期）和71周龄（淘汰期）。采样期间鸡场未发生疫病，SPF蛋鸡不使用抗生素或疫苗。商用蛋鸡90日龄前使用过土霉素、链霉素、红霉素、氨苄西林和卡那霉素。在这两种蛋鸡场里，不同日龄的鸡在不同的鸡舍。一个鸡舍采集20个点，混匀得到3个生物学重复样本，两种蛋鸡各5个日龄，所以总共得到30份样品。粪样放置干冰中带回实验室进行大肠杆菌分离后，在提取DNA前在液氮中保存。

1.2 粪样DNA 抽提和PCR扩增 根据E.Z.N.A.■soil试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物对V3～V4可变区进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性3 min，27个循环（95℃ 变性30s，55℃退火30s，72℃ 延伸30s），最后72℃延伸 10min（PCR仪：ABI GeneAmp■9700型）。扩增体系为20μl，4μl 5×Fast Pfu缓冲液、2μl 2.5mM dNTPs、0.8μl引物（5μM）、0.4μl FastPfu 聚合酶和10ng DNA模板。

1.3 Illumina Miseq测序 使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，Union City，CA，USA） 进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA） 进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台（Illumina，San Diego，USA）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。

1.4 数据处理 原始测序序列使用Trimmomatic 软件质控，使用FLASH软件进行拼接：①设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，去除质控后长度低于50bp的序列；②barcode需精确匹配，引物允许2个碱基的错配，去除模糊碱基；③根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接，overlap需大于10bp，去除无法拼接的序列。使用的UPARSE软件（version 7.1 http：//drive5.com/uparse/），根据97%的相似度对序列进行OTU聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库（SSU123），设置比对阈值为70%。

1.5 大肠杆菌的分离鉴定和药敏试验 每种类型每个时间点的粪便样品在3个麦康凯培养基（Merck Millipore，德国）进行划线，在37℃下培养18～24h后选取疑似大肠杆菌菌落，利用VITEK■ 质谱仪进行鉴定（BioMerieux，法国）。每种类型的鸡粪便都获得45株大肠杆菌用琼脂稀释法进行药敏试验，确定抗生素种类——氨苄西林、多西环素、氟苯尼考、头孢噻呋、新霉素、庆大霉素和多粘菌素对大肠杆菌的最小抑菌浓度，根据CLSI标准2016版判定结果[8]。

1.6 生物信息学和数据统计分析方法 主坐标分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA），LEfSE分析在上海美吉生物免费云平台进行（https：//www.i-sanger.com/）。变异系数（coefficient of variation）为标准差与平均值的商（SD/Mean）。在软件GraphPad Prism7中利用Mann-Whitney算法進行差异显著性检验。

2 结果

2.1 16S rRNA基因高通量测序数据分析 在方法与材料中已经列出了两种类型蛋鸡5个时间点的粪便样本。在进行Illumina MiSeq测序和质量过滤（quality-filtering）后，30个样本总共获得1，148，889个序列（sequences），序列平均长度为442 bp。为了降低每个粪便样本间的测序深度差异造成的影响，这些序列被统一抽平至样本中最小序列数（每个样本16，718个序列）。

2.2 SPF鸡粪便菌群丰富度低于商品蛋鸡，但组成更加均一 为了比较SPF鸡和商品蛋鸡粪便菌群的丰富度，我们统计了两种粪便样本中OTUs的数量，以及计算了辛普森指数（Simpson index），发现两种蛋鸡粪便菌群α多样性有显著的差异。SPF蛋鸡粪便菌群（SPF）中OTU的数量显著低于商品蛋鸡（COM），但辛普森指数前者显著高于后者（P<0.001，Mann-Whitney test）（图1A），这一结果表明SPF鸡粪便菌群丰富度低于商品蛋鸡，但其菌群更加均一。值得一提的是，两种蛋鸡粪便菌群都表现出随日龄增加而增加的趋势（图2A）。30个样本总共获得1330个OTUs，其中商品蛋鸡组有1270个OTUs，而SPF鸡组有511个OTUs。两组共同拥有451个OTU（图1B），且其中的208个在丰度上存在显著差异（P<0.05，Mann-Whitney test）（图2B）。

Chao指数变异系数（coefficient of variation）用来衡量蛋鸡粪便菌群丰富度的稳定性。结果发现，SPF蛋鸡粪便菌群的丰富度稳定性大于商品蛋鸡，而且两组都在25周龄的日龄点时拥有较为稳定的粪便菌群丰富度（图2C，D）。

基于Brays-Curtis算法的主坐标分析发现，SPF鸡组内粪便菌群聚成一组，与商品蛋鸡可显著区分开，表明两种蛋鸡粪便菌群组成显著不同。与此相似，基于Unweighted UniFrac距离的柱状图也表明，SPF鸡组内不同日龄间鸡的粪便菌群组成相似程度要大于商品蛋鸡粪便菌群，反之如此 （图1C，D）。

鸡的日龄可能是影响鸡粪便菌群发展因素之一，我们以鸡的日龄作为一个影响粪便菌群的影响因子，在SPF鸡和商品蛋鸡组内对不同日龄鸡的粪便菌群进行比较，主坐标分析发现，无论SPF鸡还是商品蛋鸡，鸡的日龄在鸡粪便菌群的发展中都起到了一定的作用（图3A，B）。

综上，可以看出养殖模式及日龄都会影响鸡的粪便菌群。

2.3 两种蛋鸡粪便菌群在门（phylum）和属（genus）水平的组成 β多样性分析结果显示不同养殖模式和不同日龄都影响蛋鸡粪便菌群的发展。通过将所得的OTUs在相应数据库中进行比对，得到了具体的粪便菌群组成。在门（phylum）分类水平上，SPF蛋鸡和商品蛋鸡粪便菌群都主要由厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes） 及放线菌门（Actinobacteria）组成。但是两者在这四个菌门的细菌相对丰度却具有显著差异，SPF蛋鸡粪便菌群拥有更多的厚壁菌门细菌，而含有较少的变形菌门、拟杆菌门和放线菌门细菌（图4A；图5A）。

在属（genus）分类水平上，有9个属的细菌相对丰度在所有样本中大于1%（图4B），两者蛋鸡的粪便菌群主要由乳杆菌属（Lactobacillus）、埃希氏-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）细菌组成，SPF蛋鸡粪便菌群含有更多的乳杆菌属、粪杆菌属（Faecalibacterium）细菌，而商品蛋鸡含有更多的拟杆菌属（Bacteroides）、假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、梭菌属（Clostridium）、链球菌属（Streptococcus）以及克雷伯菌属（Klebsiella）细菌（图5B）。

2.4 SPF鸡粪便中大肠杆菌的抗药性水平低于商品蛋鸡 药敏试验结果显示SPF鸡粪便中大肠杆菌对7种抗生素抗药性水平显著低于商品蛋鸡（P=0.0156，Mann-Whitney test；图6A），鉴定的45株粪便大肠杆菌中有5株表现1重抗药，5株表现2重抗药，无3重及以上抗药菌株。而商品蛋鸡鉴定的45株粪便大肠杆菌中至少有1株表现1重抗药，22株表现至少3重抗药（图6B）。MIC的频率分布显示SPF鸡粪便大肠杆菌的MIC集中于热图底部，而商品蛋鸡大肠杆菌菌株的MIC多集中于热图上部，整体来看SPF鸡粪便大肠杆菌的抗药性水平显著低于商品蛋鸡（图6C）。两组内大肠杆菌MIC平均水平显示，SPF鸡粪便大肠杆菌对氨苄西林、头孢噻呋、多粘菌素、新霉素、多西环素的抗药性水平都显著低于商品蛋鸡（图6D）。

3 讨论

鸡的粪便、嗉囊、十二指肠、回肠和盲肠等部位的菌群组成不同[9]，由于盲肠菌群对鸡的生理方面具有重要作用，因此鸡肠道菌群的研究多关注盲肠[10]。盲肠菌群与粪便菌群组成不同，但是核心菌群相同，利用粪便样本可以一定程度的展示盲肠菌群的动态变化[11]。我们利用16S rRNA基因高通量测序技术比较分析了两种不同养殖环境下的蛋鸡5个不同日龄的粪便菌群。结果SPF鸡与商品蛋鸡的粪便菌群在α多样性和β多样性方面明显不同，SPF鸡粪便菌群更加均一，而商品蛋鸡菌群更加丰富，且菌群丰富度随日龄增加呈现增加趋势。两种蛋鸡粪便菌群在门和属水平组成存在显著差异，SPF鸡拥有更少的变形菌门细菌，如假单胞菌属、不动杆菌属、梭菌属、链球菌属和克雷伯菌属等。有研究报道SPF鸡粪便中厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门丰度占95%以上；乳杆菌属、链球菌属、拟杆菌属、肠球菌属为优势菌属[12]。也有研究表明200日龄SPF鸡粪便菌群在门水平上主要由厚壁菌门、变形菌门组成，在属水平主要由肠球菌屬组成[13]。本研究中，通过与普通商品蛋鸡进行比较，发现SPF蛋鸡粪便菌群拥有更多的厚壁菌门细菌，而含有较少的变形菌门、拟杆菌门和放线菌门细菌。鸡的肠道菌群虽然会因不同区域有所不同，综合来看，其肠道菌群是由较多厚壁菌门组成，且拥有较多乳杆菌属和肠球菌属细菌。

SPF鸡粪便菌群丰富度较少的原因，可能是封闭环境、无菌饲料养殖造成的。有报道称野生动物与家养动物的肠道菌群存在差别，散养鸡比笼养鸡肠道菌群更加丰富[14]，这表明与外界环境接触可能会促进鸡肠道菌群的发展。除了不同品种，不同养殖模式及地理环境对鸡肠道菌群的发展也具有重要作用[15]。我们的研究结果也显示不同养殖模式下SPF鸡和商品蛋鸡的粪便菌群显著不同，且肠道菌群的丰富度会随着日龄的增加而增加，这与国外其他报道也是一致的[16]。鸡等家禽的肠道菌群在食物的消化、吸收以及抗病方面发挥重要作用[17]，因此，通过调节动物肠道菌群来提高动物表现的方法成为可能。研究人员尝试通过益生菌、益生元，甚至是粪菌移植来调节动物的肠道菌群，提高动物表现。让人惊喜的是，粪菌移植在治疗复发性艰难梭菌患者时，不仅可以调节受体宿主的肠道菌群，同时也可以清除大部分抗药性机会致病菌[7]。SPF鸡在无菌环境中饲养，饲喂无菌水和无菌饲料，不使用任何抗生素，且粪便中大肠杆菌的抗药性很低，菌群更加敏感，且SPF鸡不携带特定病原体，安全性好。因此SPF鸡作为粪菌移植合适的供体用于降低细菌抗药性代表了一个安全有效的新方法。

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Comparative analysis of the fecal microbiota and Escherichia coli antibiotic resistance in specific-pathogen-free （SPF）and commercial layer chickens

ZHU Jianshen1，2，WANG Xi1，3，ZHANG Yin1，WANG Huaizhong1，ZHANG Qing1，LUO Yanbo1，

LI Lulu1，HU Ming1，DAI Meixue3，LIU Yuqing1，2，3，QI Jing1，3

（1.Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding， Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China；

2. School of Life Sciences， Shandong University， Jinan 250100， China；

3. School of Life Sciences， Shandong Normal University， Jinan 250014， China）

Abstract：Modulating microbiota with fecal microbiota transplantation （FMT） is a novel way to reduce antimicrobial resistance （AMR） in chicken husbandry. However， optimal fecal microbiota donors are required for effective FMT.Here，we performed a 16S rRNA gene sequencing study to analyze the fecal microbiota composition of two candidate donors，specific-pathogen-free （SPF） chickens and commercial layer chickens （COM） exposed to different rearing environments at five different time-points. Antimicrobial susceptibility testing （AST） was performed to determine the antibiotic resistance of Escherichia coli （E.coli） isolated from the feces of the two types of chickens. The results showed that the composition of the fecal microbiota of both laying hens showed an increasing trend with increasing age， and the commercial layer chickens possessed more richness microbiota than SPF layer chickens， while SPF layer chickens harbored a more uniform microbiota community. In relation to phylum composition， SPF layer chickens possessed a greater abundance of Firmicutes， while commercial layer chickens possessed more Proteobacteria， Bacteriodetes and Actinobacteria. At the genus level， the dominant genera in both kinds of layer chickens were Lactobacillus， Escheria-Shigella.However，there was higher relative abundance in genus Lactobacillus and Faecalibacterium in SPF Group，while COM group possessed higher relative abundance in genus Bacteroides， Pseudomonas， Acinetobacter， Clostridium，Streptococcus and Klebsiella. AST showed that the E. coli isolated from commercial chicken feces had a high antibiotic resistance， multi- drug resistance ratio and minimum inhibitory concentration frequency distribution than the E.coli isolated from SPF chickens. This study deeply analyzed the differences in fecal microbiota of two different chickens at different ages. Combined with the comparison of E. coli antibiotic resistance， we believed that SPF chickens might be appropriate donors of fecal material for use in FMT to reduce AMR in the chicken industry.

Key Words：SPF chicken；commercial laying hens；fecal microbiota；antibiotic resistance□