2型糖尿病患者常见体质与IL-6、IL-10、IL-10R1基因多态性的相关性研究

沈 艳，唐 红，周 端，陈昕琳，王佑华

(上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

糖尿病是由先天遗传和后天环境等因素共同作用而导致的一组以糖代谢紊乱为主要表现的临床综合征。在个人禀赋和环境因素影响下，不同个体有不同的证候表现，而相对稳定和整体性的症状和体征便会成为研究一种疾病异质性从而更有效地指导临床的线索[1]。这种相对稳定和整体性的症状和体征常反映个体的中医体质，而体质与基因间有着密切的相关性。临床研究也显示，2型糖尿病患者常伴随多种炎症因子浓度的改变，考虑其发病可能与相关炎症因子有关[2-3]。因此，笔者研究2型糖尿病患者常见体质阴虚质和痰湿质与炎症因子白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)及其受体的多态位点的相关性。

1 资料与方法

1.1 诊断标准 采用1999年WHO制定的2型糖尿病诊断标准，即有症状者，空腹血糖≥7.0 mmol/L，或口服葡萄糖耐量试验中糖负荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L，或随机血糖≥11.1 mmol/L；症状不典型者，必须另选一天重复测试以确诊。

1.2 中医体质分类标准 按照中华中医药学会《中医体质分类与判定》[4]进行中医体质类型的判定。

1.3 临床资料 395例2型糖尿病患者均来自2015年1月至2016年6月龙华医院及4家社区卫生服务中心，均经门诊或体检确诊，其中男172例，平均年龄(74.71±7.35)岁，女223例，平均年龄(73.12±8.37)岁。按是否阴虚质分为：阴虚质137例，其中男50例，女87例，平均年龄(71.72±7.97)岁；非阴虚质258例，男122例，女136例，平均年龄(74.33±7.47)岁。按是否痰湿质分为：痰湿质92例，其中男29例，女63例，平均年龄(71.89±7.92)岁；非痰湿质303例，其中男143例，女160例，年龄(74.32±7.79)岁。

1.4 纳入标准 年龄45～85岁，性别不限，符合诊断标准。研究对象阴虚质转化分≥40分，判定为“是”者，或30～39分，判定为“倾向是”者，均被纳入阴虚质组。痰湿体质转化分≥40分，判定为“是”者，或30～39分，判定为“倾向是”者，均被纳入痰湿质组。

1.5 排除标准 伴有心、肺、肝、肾、血液及胃肠道严重原发病者；各种病毒、细菌感染者，传染性疾病、精神疾患或行为障碍者；因文化程度等因素不能很好地理解调查问卷内容者。

1.6 观察指标和检测方法

1.6.1 中医体质分类 采用问卷调查法，《中医体质分类与判定》共分9种中医体质类型，共有9个亚量表构成67个条目，信息采集形式采用自我评价结合临床中医师访谈。收集所有研究对象的临床资料，包括姓名、性别、年龄等。

1.6.2 基因检测 本研究选取IL-6、IL-10及白细胞介素-10受体1(interleukin-10 receptor 1, IL-10R1)基因多态性研究作为切入点。对入选对象均进行中医体质辨识并检测IL-6的rs1800796位点、IL-10的rs1800871位点、IL-10R1的rs2228055位点的基因分型。抽取患者外周血作为检测样本，所有研究对象抽血前空腹10 h，均于上午7:00-8:00抽取静脉血2 mL，然后注入含肝素抗凝剂的真空管中混匀，置于4 ℃冰箱保存待用。首先采用QIAGEN的Flexigene DNA试剂盒提取全血提取DNA，再运用SNP技术平台的多重PCR进行DNA的基因多态性检测。根据基因多态性位点的位置，由上海生工生物工程股份有限公司分别用Primer3设计合成引物，并做ePCR验证。实验步骤：①对DNA片段进行扩增；②对PCR产物进行纯化；③进行SNaPshot PCR扩增；④对SNaPshot PCR产物进行纯化；⑤电泳样品制备；⑥GeneMapper 4.0软件分析。IL-6的rs1800796位点上游引物为GCACAGAGAGCAAAGTCCTC，下游引物为AGCTGAAGTCATGCACGAAG；IL-10的rs1800871位点上游引物为CATTCTATGTGCTGGAGATGG,下游引物为TTGCCCATTCCAGAATACAA；IL-10R1的rs2228055位点上游引物为TCATTTTTGTTTCAGTTCACACAC，下游引物为AGCAGCACCTAACACAGTGG。

2 结果

2.1 基因测序结果 IL-6 rs1800796存在C/G多态性，有GG型、CC型和GC型3种基因型。IL-10 rs1800871存在C/T多态性，有CC型、TT型和CT型3种基因型。IL-10R1 rs2228055存在A/G多态性，有AA型、GG型和GA型3种基因型。

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验 采用χ2检验对各观察组3种基因的基因型分布频率进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，以上结果显示阴虚质组、痰湿质组IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055基因型分布实际值与预期值的差异无统计学意义(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。结果表明纳入的2型糖尿病人群样本来自一个较大的、处于随机分配平衡状态的群体，具有群体代表性。见表1、表2。

表1 阴虚质、非阴虚质各组基因的Hardy-Weinberg平衡定律检验

注：纯合子预期基因型频率=某等位基因频率的平方，杂合子预期基因型频率=2×两种等位基因频率的乘积，预期例数=总数×预期频率

表2 痰湿质、非痰湿质各组基因的Hardy-Weinberg平衡定律检验

注：纯合子预期基因型频率=某等位基因频率的平方，杂合子预期基因型频率=2×两种等位基因频率的乘积，预期例数=总数×预期频率

2.3 阴虚质、痰湿质IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055基因型与等位基因分布情况比较 采用R行×C列χ2检验，痰湿质与非痰湿质2型糖尿病患者IL-10 rs1800871基因型分布的差异有统计学意义(P<0.05)，进一步分析显示：痰湿质组CT基因型比例明显低于非痰湿质CT基因型比例(30.4%vs45.9%，χ2=6.137，P=0.013)。两组间IL-6 rs1800796、IL-10R1 rs2228055基因分型分布的差异均无统计学意义(P>0.05)。阴虚质和非阴虚质2型糖尿病患者IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055基因型分布的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3、表4、表5。

表3 阴虚质和痰湿质2型糖尿病患者IL-6 rs1800796基因型与等位基因分布频率比较

表4 阴虚质和痰湿质2型糖尿病患者IL-10 rs1800871基因型与等位基因分布频率比较

注：与非痰湿质比较，*P<0.05

表5 阴虚质和痰湿质2型糖尿病患者IL-10R1 rs2228055基因型与等位基因分布频率比较

2.4 阴虚质、痰湿质IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055基因型非条件Logistic回归分析 以阴虚质(1=是，0=否)为应变量，以IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055各基因型为自变量，进行二项分类Logistic回归分析。结果提示，以IL-10 rs1800871 CC为参照，L-10 rs1800871 CT为2型糖尿病阴虚质的主要危险因素(P=0.019，OR值为2.593，95% CI为1.710～5.746)。以痰湿质(1=是，0=否)为应变量，以IL-6 rs1800796、IL-10 rs1800871、IL-10R1 rs2228055各基因型为自变量，进行二项分类Logistic回归分析。结果提示，以IL-10 rs1800871 CT为参照，IL-10 rs1800871 TT为2型糖尿病痰湿质的主要危险因素(P=0.025，OR值为1.809，95% CI为1.076～3.041)。见表6、表7。

表6 2型糖尿病患者阴虚质的多因素非条件Logistic回归分析

表7 2型糖尿病患者痰湿质的多因素非条件Logistic回归分析

3 讨论

炎症因子是形成慢性炎症的一个重要因素[5]，能调节多种细胞的炎症和免疫应答[6]，它由促炎因子和抗炎因子所组成，二者决定着炎症的形成、发展和消退。目前认为炎症因子中肿瘤坏死因子、IL-6和C反应蛋白是反映慢性炎症的主要指标。IL-10与心血管事件的相关性研究显示其对动脉粥样硬化斑块的形成具有保护作用[7]。rs1800871位于IL-10基因启动子区域，其变异对IL-10基因的表达具有影响作用[8]。有学者研究发现，IL-10 rs1800871基因位点的C等位基因与颈动脉内膜中层厚度具有相关性[9]。有学者对中国人群IL-10基因多态性与2型糖尿病遗传关联性作荟萃分析显示，IL-10基因的SNP43位点多态与2型糖尿病存在一定遗传关联性[10]。

中医治未病思想源远流长，《素问·四气调神大论》明确指出：“圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱。”这一思想对糖尿病及其并发症早期防治具有重要意义[11-12]。1980年代王琦等主编的《中医体质学说》标志着中医体质学说的正式确立。中医体质禀受于先天，得养于后天，说明先天的遗传基因是中医体质形成的基础，它决定着个体的某些特性在生命过程中不会轻易受环境改变。不同中医体质人群疾病的转归及对邪气的易感性存在差异。孙理军等[13]对糖尿病患者进行体质调查，发现痰湿质与阴虚质占一半以上。韩文坛[14]对糖尿病患者进行研究，显示以平和质、阴虚质、气虚质及痰湿质为主，阴虚质、气虚质及痰湿质是导致生存质量严重下降的主要体质。结合笔者前期的研究结果，糖尿病患者的体质主要是阴虚质及痰湿质。《灵枢·五变》曰：“五脏皆柔弱者，善病消瘅。”尤以阴虚体质最易患病，糖尿病患者多见阴虚质，与其“阴虚为本，燥热为标”基本病机相一致；过食肥甘厚味，导致脾胃运化失职，酿生痰湿，日久导致肥胖，胰岛素敏感性降低引起糖尿病，正如《素问·奇病论》所说“此肥美之所发也”。

本研究结果显示，痰湿质2型糖尿病患者IL-10 rs1800871 CT基因型比例明显低于非痰湿质(P<0.05)，可能IL-10 rs1800871 CT基因型为痰湿质保护因素。多因素非条件Logistic回归分析结果提示，以L-10 rs1800871 CC基因型为参照，IL-10 rs1800871 CT基因型为2型糖尿病阴虚质的主要危险因素(P=0.019)；以IL-10 rs1800871 CT基因型为参照，IL-10 rs1800871 TT基因型为2型糖尿病痰湿质的主要危险因素(P=0.025)。结果提示IL-10 rs1800871基因变异可能是2型糖尿病阴虚质、痰湿质的分子遗传学基础之一。

本研究从分子生物学角度探讨IL-6、IL-10、IL-10R1基因多态性与2型糖尿病常见体质的相关性，初步证实IL-10 rs1800871基因多态性与2型糖尿病阴虚质、痰湿质的相关性，为糖尿病患者的早期防治提供一定的客观依据。以此针对性地改善中医体质，调和阴阳，有利于改善体质偏颇，从而截断或延缓疾病的发生发展[15]。但是，2型糖尿病是一种多基因相关疾病，病因涉及遗传、环境等多种因素，其发生发展过程极其复杂，同时，IL-10也是一种多效性的细胞因子，因此本研究结果只能说明IL-10的基因多态性参与了2型糖尿病常见体质易感性的形成。IL-10基因多态性对2型糖尿病常见体质易感性的确切诊断价值，以及本研究涉及的基因与其他基因间的相互关系等，仍需扩大样本量进一步研究。