麸皮固体培养产朊假丝酵母菌的培养基优化研究

陆海游，张 怡，童应凯，何炜璐，舒珊珊，张淇珊，牛家蕾

(天津农学院 农学与资源环境生物技术系 天津300384)

0 引 言

近年来，我国小麦年产量已超过 1亿吨，加工后的麦麸每年可达 2000多万吨，它是主要的农副产品资源之一[1]。由于麸皮容易获得且成本较经济，以麸皮和玉米粉为底料培养菌种生产生物饲料，在养殖业的实际应用中有重要意义。目前，用于微生物发酵生产蛋白质饲料的菌株主要是霉菌、酵母菌和细菌[2-3]。

本研究选用产朊假丝酵母为发酵菌种。有关研究表明：经过现代科学技术加工处理后，产朊假丝酵母菌可适用于现代新型功能食品的加工和食用[4]。在21世纪初，产朊假丝酵母在一些欧美国家的饲料工业中被广泛用作优良的饲料蛋白，或用于其他农作物材料，如稻草和油菜籽饼的发酵，并作为饲料蛋白质生产或者排毒[5]。目前其广泛用于医药、食品工业和其他化妆品原料，并经 FDA批准可用于食品添加剂的安全酵母[6]。因此，利用产朊假丝酵母生产饲用添加剂或发酵剂具有良好的应用前景。

本研究旨在利用固体发酵方法，尝试添加麸皮与玉米粉来优化产朊假丝酵母发酵培养基，以提高其生产力并为单细胞蛋白的应用创造有利条件[7]，从而为新型的营养饲料提供一个良好的研究基础理论。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

产朊假丝酵母：天津农学院农学与资源环境学院微生物实验室保藏菌种。

1.1.2 种子液培养基

YEPD培养基(%)：酵母膏1.0，蛋白胨2.0，葡萄糖2.0，pH值6.0，115℃灭菌20min。

1.1.3 种子液制备

将产朊假丝酵母菌接种于 YEPD液体培养基中，摇床30℃、180r/min培养20h。

1.1.4 固体发酵培养基的制备方法

用 250mL三角瓶装料 10g(9g麸皮+1g玉米粉)为底物，加入 0.5%硫酸铵、0.05%磷酸二氢钾、9%葡萄糖，再加入一定量蒸馏水，搅拌均匀后115℃灭菌20min，然后接入种子液，30℃发酵。

硫酸铵溶液制备：将 2.5g硫酸铵溶于50mL蒸馏水中，固体培养基中添加1mL硫酸铵溶液。

磷酸二氢钾溶液制备：将0.25g磷酸二氢钾溶于50mL蒸馏水中，固体培养基中添加 1mL磷酸二氢钾溶液。

葡萄糖溶液制备：将 11.25g葡萄糖溶于 50mL蒸馏水中，固体培养基中添加4mL葡萄糖溶液。

1.2 单因素试验方法

1.2.1 接种量单因素试验

利用上文1.1.4的方法，将接种量设为4%、8%、12%，分别加入7mL蒸馏水，形成1∶1.3的料液比，进行固体发酵 2d，然后测定产朊假丝酵母数量，得到固体发酵最佳接种量。

1.2.2 加水量单因素试验

利用上文1.1.4的方法，采用1.2.1中确定的最佳接种量，将加水量设为 100%、150%、200%、250%，即料液比为 1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5，固体发酵2d，用血球计数板进行计数，测定产朊假丝酵母数量，得到固体发酵中最佳加水量。

1.2.3 发酵时间单因素试验

利用上文1.1.4的方法，采用1.2.1与1.2.2试验结果，将发酵时间设定为 12、24、36、48、60h，发酵结束后分别测定产朊假丝酵母数量，从而确定最佳固体发酵时间。

1.3 正交试验方法

1.3.1 对添加剂的正交试验

以 9g麸皮和 1g玉米粉为底物，根据单因素试验 1.2所得结果，对硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、葡萄糖4种添加剂进行L9(43)的正交试验，确定其最佳固体发酵配方，正交表设计如表1和表2所示。

表1 正交试验各因素所占百分比Tab.1 Percentage of each factor in orthogonal test

由于加入量较少，需将各因素配制成溶液以便添加：①将 5g硫酸铵加水定容至 50mL容量瓶中；②将0.05g硫酸镁加水定容至50mL容量瓶中；③将0.5g磷酸二氢钾加水定容至 50mL容量瓶中；④将20g葡萄糖加水定容至100mL容量瓶中。

表2 正交试验处理Tab.2 Implementation table of orthogonal test

将表2所处理试剂分别加入刻度试管，置于以9g麸皮和 1g玉米粉为底物的固体培养基中，再加入蒸馏水(加水量为 1.2.2试验结果)，充分搅拌，经过高压灭菌后，进行接种(接种量为 1.2.1试验结果)，搅拌均匀。接种完成后，将样品放入 30℃恒温培养箱培养(培养时间为 1.2.3试验结果)，测定菌种数量，根据极差分析法分析得到最佳试验结果，选出最佳培养基配方。

1.3.2 正交验证试验

利用正交试验所得最佳配方，进行重复验证实验，测得酵母菌数，确定最佳配方实验的正确性。

1.4 产朊假丝酵母菌菌数测定方法

培养后样品称取 1g，倒入离心管，加入 20mL蒸馏水，振荡离心约1min后，另取试管加入9mL蒸馏水及1mL离心液混匀，取100μL注入血球计数板凹槽，在光学显微镜下进行观察计数。测菌数(稀释倍数为200，样品量为1g)，计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 接种量试验结果分析

通过设定不同接种量，探究接种量对于产朊假丝酵母固体发酵的影响。试验结果如图1所示。

图1 接种量试验结果Fig.1 Results of inoculation volume test

由图1可知，在固体培养基中接种量为 4%时，产朊假丝酵母菌数量为 1.055×109个/g；接种量为8%时，酵母菌数为 1.085×109个/g；接种量为 12%时，酵母菌数最多，达 1.374×109个/g。分析数据发现，随着接种量的增加，固体发酵体系中产朊假丝酵母数量增多。主要是由于菌种接种量越多，越容易在有限时间内快速达到菌种数量的最大值。但接种量不是越多越好，因为接种量过大，一是会造成不必要的浪费，二是会造成菌种间竞争关系，反而抑制固体发酵的有效进行。所以在后续正交试验中，选取接种量为12%。

2.2 加水量试验结果分析

通过设定不同加水量，探究加水量对于产朊假丝酵母固体发酵的影响。试验结果如图2所示。

由图2可知，当固体发酵体系中料液比为 1∶1时，产朊假丝酵母菌数为 1.136×109个/g，获得的酵母菌数最多；当料液比为 1∶1.5时，酵母菌数为1.074×109个/g；当料液比为 1∶2时，酵母菌数为1.048×109个/g；当料液比为 1∶2.5时，酵母菌数为1.055×109个/g。料液比与产朊假丝酵母菌数量的关系整体呈现先降低后升高的趋势，但总体上看，后期趋势变化不太明显。说明料液比为 1∶1时，酵母菌能更好与固体发酵底物接触，从而能达到更好的发酵效果；当加水量过多时，一方面会稀释加入的微量元素，导致酵母菌吸收营养物质效率下降，另一方面加水量过大会造成发酵体系含氧量下降，影响酵母菌有氧代谢。因此在正交试验中，选择料液比为 1∶1，可以更好地进行麸皮固体发酵。

图2 加水量试验结果Fig.2 Results of water addition test

2.3 发酵时间试验结果分析

通过设定不同的发酵时间，探究不同阶段的发酵时间对于产朊假丝酵母固体发酵的影响。试验结果如图3所示。

图3 发酵时间试验结果Fig.3 Results of fermentation time test

由图3可知，在发酵经过12h时，产朊假丝酵母菌数为 1.91×108个/g，在发酵经过 24h时，酵母菌数为 6.36×108个/g；在发酵经过 36h时获得的酵母菌数量最多，酵母菌数达到 1.304×109个/g；在 48h时，酵母菌数为 1.035×109个/g；在 60h时，酵母菌数为 1.095×109个/g。由于后期变化不太明显，可以初步判断发酵时间与产朊假丝酵母菌数量的关系整体呈现出先升高后降低的趋势。通过分析数据发现，产朊假丝酵母菌在 36h时处于对数生长期，此时固体发酵体系营养物充足，菌种间暂时无竞争关系，菌种生长代谢极为活跃；随着发酵时间的延长，营养物质被大量消耗，菌种间逐渐产生竞争关系，致使菌种数量逐渐下降。所以在后续的正交试验中，选择菌种发酵时间为正处于对数生长期的36h，作为产朊假丝酵母菌固体发酵的最佳培养时间。

2.4 正交试验结果分析

基于 2.1、2.2和 2.3的试验结果，进行添加剂的正交试验，测定产朊假丝酵母菌的数量后，通过极差分析选出最佳添加剂配方，结果如表3所示。

表3 正交试验结果分析Tab.3 Analysis results of orthogonal test

根据表3中 K值可知，能获得最多产朊假丝酵母菌生物量的配方是：0.5%硫酸铵，0.05%磷酸二氢钾，6%葡萄糖，即 4号试验为最佳配方组，所得的产朊假丝酵母菌生物量最高。通过R值的分析可知，影响正交试验结果的因素依次为葡萄糖＞硫酸铵＞硫酸镁＞磷酸二氢钾。对相关性分析可知，葡萄糖与磷酸二氢钾的含量与试验结果呈正相关，硫酸铵和硫酸镁的含量与试验结果呈负相关。产朊假丝酵母菌的生物量会随着葡萄糖与磷酸二氢钾含量的增加而增多，后期试验可适当多添加葡萄糖与磷酸二氢钾含量。另一方面，由于硫酸镁不添加不会对发酵体系造成影响，硫酸铵虽然需要添加，但其负方面影响十分微小，可以忽略其影响，在后期试验中可尝试不添加此添加剂。

2.5 最佳配方重复实验结果验证

最佳配方重复实验做2组：依照1.1.4中的固体培养基制备方法，称取9g麸皮和1g玉米粉，以此为底物，加入 0.5%硫酸铵，0.05%磷酸二氢钾，6%葡萄糖，加入蒸馏水，制成 1∶1料液(加入菌液后料液比为 1∶1)，灭菌后接入 12%产朊假丝酵母菌液，30℃培养36h。

按照 2.4中酵母菌数的测定方法，对产朊假丝酵母菌的菌数进行测定后，结果为 6.03×108个/g，与正交试验中第4组试验所获得的酵母菌数量相近，即获得的产朊假丝酵母菌数量仍最多。因此，此配方为最佳配方。

3 问题与讨论

3.1 避免菌体生长不均

试验过程中，发现菌体生长不均一，其主要原因在于接种时没有将培养基与菌种充分搅拌均匀，使营养成分与菌液分布不均匀。在固体培养基中，酵母菌的活动能力没有在液体培养基中强，导致菌体在固体培养基中分布不均，不能充分利用营养成分，菌体生长受限，从而影响试验结果。所以在接种时，一定要将菌种与培养基搅拌均匀，避免实验误差出现。

3.2 接种量的选择问题

在接种量单因素试验时，最终选择 12%为最优结果。探讨试验中，将接种量扩大到 20%，发现试验结果与 12%的试验结果近似，考虑到节约成本问题，没有再次扩大接种量，直接使用12%的接种量。

3.3 正交试验中各因素的选择

葡萄糖是生物科学领域中分布广泛且最重要的单糖，是大多活细胞的主要能量来源及代谢的中间产物，在产朊假丝酵母细胞中能够为其提供生命活动所需的能量。硫酸铵在酵母菌培养中，能为其提供适量无害的氮源。磷酸二氢钾和硫酸镁的主要作用是为给产朊假丝酵母提供可利用的钾离子和镁离子，在固体发酵培养过程中，它们能使产朊假丝酵母菌在特定的环境下迅速生长，提高菌种产量。

4 结 论

本试验主要是对产朊假丝酵母进行固体发酵，以麸皮和玉米粉为底料，其比例为 9∶1，利用单因素试验(接种量、料液比、发酵时间)结果，为后续的正交试验提供相应的基础。根据正交试验得出，在固体底物中添加 0.5%硫酸铵，0.05%磷酸二氢钾，6%葡萄糖，加入适量的蒸馏水，制成料液比 1∶1的发酵底物，再接入 12%的处于对数生长期的产朊假丝酵母菌液，在 30℃培养 36h能得到较高的产朊假丝酵母菌数量，在此条件下产朊假丝酵母能够以最佳的生长状态生长。