减肥饮品发酵条件研究

聂志岩，张 怡，王德慧，仇雅婷，桑珠普赤，张皓钰，张乃楠，童应凯

(天津农学院农学与资源环境学院生物技术系 天津300384)

0 引 言

目前世界卫生组织制定了衡量整体肥胖的指标是体重指数(Body Mass Index，BMI)，即体重(kg)除以身高(m)的平方作为衡量肥胖的标准。以 BMI体重指数高于25kg/m2作为超重的判定条件。我国现阶段的超重人数已达到了 2.1亿，肥胖人数达到了9000万人以上，并且该数据仍在不断增长。许多人嗜食肥甘厚味，由于工作等原因缺乏运动，导致肥胖。本项目通过对有助于减肥降脂的食材和中草药进行发酵研究，旨在研制能够有效降低血脂、减轻体重的品质优良产品，从而帮助肥胖人群远离疾病、增强体质。此种产品具有调整肠道益生菌、促进脂肪分解、增加机体超氧化物歧化酶活性等功效，对于改善人们身体素质有一定帮助。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与菌种

原料：中药店铺出售的荷叶、山楂、绞股蓝、决明子、葛根。

菌种：纳豆芽孢杆菌(本实验室保藏菌种)。

1.1.2 培养基

取固体粉末荷叶 4g、山楂 2g、绞股蓝 1g、决明子 1g、葛根 1g，加蒸馏水 100mL于三角瓶中，包扎，灭菌；然后放置至室温待培养基晾凉以后，进行接种发酵试验。

中药培养基(%)：荷叶 4.0，山楂 2.0，绞股蓝1.0，决明子 1.0，葛根 1.0，121℃灭菌 20min。

1.2 试验方法

取适量固体荷叶、山楂、绞股蓝、决明子、葛根，放入烘箱中 70℃烘干 3～4h，取出置于粉碎机内粉碎约 3min，然后装入密封袋中置于 4℃冰箱保存备用。

2 测定方法

2.1 感官分析

观察发酵饮品的外观颜色、气味以及味道，按照表1进行评分，选出酶活性较高且感官评价综合得分较高者。

表1 感官评价Tab.1 Sensory evaluation table

2.2 正交试验方法

按照表2条件(接种量、发酵温度、发酵时间、加糖量)对中药进行不同处理，经过培养以后，分别测定脂肪酶和超氧化物歧化酶活性，根据极差分析法分析得到最佳试验结果，选出最优的处理条件。

表2 正交试验处理Tab.2 Implementation table of orthogonal test

2.3 脂肪酶活性测定

铜皂法原理：利用脂肪酶将橄榄油、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯水解生成脂肪酸和甘油，脂肪酸和显色剂中的铜离子反应生成铜皂蓝色铬合物，在710nm 波长下有最大吸收值，再对照脂肪酸吸光度工作曲线得出脂肪酸的浓度并计算酶的活性[1]。酶的活力单位(IU)定义为在测定条件下每分钟水解产生1μmol游离脂肪酸所用的脂肪酶量[2]。

标准曲线绘制：取浓度为 2、4、6、8、10mmol/L的油酸溶液各 4mL，分别加入 1mL乙酸铜显色剂，置于 37℃、150r/min的恒温振荡培养箱中振荡2min，空白对照用 4mL蒸馏水代替油酸，其他操作步骤相同，振荡后置于高速离心机中 4000r/min离心 10min，取上层有机相在紫外分光光度计 710nm下测吸光度，以吸光度对油酸浓度作图，即可绘制出标准曲线(图1)。

试验中分别以 75%乙醇、无水乙醇及正己烷作为油酸溶液的溶剂，试验后只有正己烷可以与其很好的相容，其余均出现不同程度的分层现象，导致试验不能正常进行，因此选用正己烷作溶剂对油酸进行稀释来进行试验[3]。

图1 脂肪酶标准曲线Fig.1 Standard curve of lipase

发酵液脂肪酶测定方法：取pH值为7.5的3mL磷酸缓冲液加入 1mL橄榄油，置于 37℃、150r/min的恒温振荡培养箱中振荡 10min，加入 1mL发酵液，置于 37℃、150r/min的恒温振荡培养箱中振荡2min[4]，取出后加入 8mL苯或者甲苯溶液，置于高速离心机中 4000r/min离心 10min，取上层有机相8mL置于一支新的离心管中，加入2mL乙酸铜显色剂，置于 37℃、150r/min的恒温振荡培养箱中振荡2min，然后于高速离心机中4000r/min离心10min，取上层有机相在紫外分光光度计710nm下测吸光度。

式中：c——脂肪酸浓度；V1——脂肪酸溶液体积；t——作用时间；V2——消耗发酵液体积。

2.4 超氧化物歧化酶活性测定

邻苯三酚方法原理：邻苯三酚也称焦性没食子酸，在酸性环境中稳定，但在弱碱性环境中会发生自氧化反应，它在自氧化时只接受一个电子生成超氧阴离子自由基，并在其自氧化过程中以一定速率生成有色中间物，SOD可以将氧负离子歧化分解成过氧化氢和氧气，从而抑制邻苯三酚的自氧化速率。每分钟反应液中 SOD抑制其 50%时，反应速率即为 SOD活力单位[5]。以 tris-HC1缓冲液为对照进行调零后在 420nm 下测吸光度，根据抑制率判断样品对氧负离子清除的能力。每份样品重复测定3次。

超氧化物歧化酶活力计算：

式中：V1——反应液总体积；V2——测定样品体积；n——样品稀释倍数。

3 结果与分析

3.1 感官分析

感官评价结果见表3。

表3 感官评价结果Tab.3 Sensory evaluation results

3.2 中药饮品发酵正交实验结果

由于本实验以脂肪酶活性高、过氧化物歧化酶活性高为最终目标，观测指标以脂肪酶活性和过氧化物歧化酶活性为主。正交试验中加糖是为了调节该饮品口感并可促进菌生长发酵，故考虑接种量、时间、温度、加糖量 4个因素的影响。脂肪酶活性、过氧化物歧化酶活性测定数据如表4所示。

各个因素的离差平方和(Si)反映了各因素对试验结果的影响，由表 4可知，对于脂肪酶活力而言，SA=1.9917，SB=1.0331，SC=0.84420，SD=0.4108，SA＞SB＞SC＞SD。就超氧化物歧化酶活性而言，SA=1200，SB=104，SC=11421，SD=587，SC＞SA＞SD＞SB。对于脂肪酶而言接种量影响最大，而对于 SOD酶而言，发酵时间影响最大。因此要获得脂肪酶活性高的中药饮品可适当加大接种量，要获得 SOD活性高的中药饮品可适当增加发酵时间，即可大幅提升酶活性。对于因素D，因中药有特殊气味，加糖量为4%时，口感较好，可满足大多数人的口感。

表4 中药饮品发酵正交实验结果Tab.4 Orthogonal experimental results of fermentation of traditional Chinese medicine drink

3.3 脂肪酶活性分析

由表5可以看出，对脂肪酶活性影响最大的因素为接种量，影响最小的因素为加糖量。

表5 脂肪酶活性方差分析表Tab.5 Lipase activity variance analysis table

由表6可以看出，对超氧化物歧化酶活性影响最大的因素为发酵时间，影响最小的因素为发酵温度。

表6 超氧化物歧化酶活性方差分析表Tab.6 Superoxide dismutase activity variance analysis table

取临界值F0.05和F0.10之间作为显著性判断标准：就脂肪酶活力而言，F1=3.0135，F0.05=19.0，F0.10=9.0，F0.05＞F0.10＞F1；就超氧化物歧化酶活力而言，F2=0.4192，F0.05=1 9.0，F0.10=9.0，F0.05＞F0.10＞F2。这表明，培养条件为 A3、B2、C1、D3时脂肪酶和超氧化物歧化酶活性均为最高值，综合感官评价，加糖量为4%时的口感较为适中。

4 问题与讨论

4.1 避免测定脂肪酶反应液不分层

试验中分别以 75%乙醇、无水乙醇及正己烷作为油酸溶液的溶剂，试验后只有正己烷可以与其很好相容，其余均出现不同程度的分层现象，导致试验后续测定不能正常进行，因此选用正己烷作溶剂对油酸进行稀释来进行试验。

4.2 乙酸铜配置

取 5%的乙酸铜固体溶解于 100mL蒸馏水中，用吡啶调节 pH值至 6.1。使用之前一定要进行过滤操作，否则会有不溶性物质沉淀影响吸光度测定值。

4.3 测定酶活性准时终止反应

测定脂肪酶活性以及超氧化物歧化酶活性时，一定要准时终止反应，避免反应时间相差很大，造成较大误差。

4.4 正交试验中各因素的选择

发酵温度、时间、接种量、加糖量都对纳豆芽孢杆菌在培养基上生长有不同程度的影响。葡萄糖是生物科学领域中分布广泛且最重要的单糖，是大多活细胞的主要能量来源及代谢的中间产物，在产纳豆芽孢杆菌中能够为其提供生命活动所需的能量，促进纳豆芽孢杆菌的增殖。

5 结 论

综合正交实验结果分析以及感官评价，可以得出最佳工艺条件为：中药烘干 4h，粉碎 3min，荷叶4g，山楂 2g，绞股蓝 1g，决明子 1g，葛根 1g，水100mL，接种量 0.6%，温度 40℃，发酵时间 14h，加糖量4%。