分子标记辅助选育抗褐飞虱和抗稻瘟病的水稻恢复系

李孝琼，陈 颖，韦 宇，郭嗣斌

(广西壮族自治区农业科学院水稻研究所/广西水稻遗传育种重点实验室，广西 南宁 530007)

【研究意义】稻褐飞虱和稻瘟病是严重影响水稻生产的两大病虫害。褐飞虱具有生长周期短、繁殖力强、易迁飞等生活习性，主要通过刺吸危害，严重时会导致大面积“冒穿”，造成水稻减产和绝收[1]；此外，褐飞虱还通过传播状丛矮病毒和齿叶矮缩病毒等[2]，给水稻生产带来损失。稻瘟病(Rice blast disease)是由子囊菌[Magnaporthegrisea(Hebert) Barrnov.]引发的真菌性病害，在全球80多个国家和地区均有发生，在我国造成的稻谷年损失量严重时高达1×109kg[3]。降低水稻病虫害最经济、有效、环保的策略就是发掘鉴定出广谱持久高抗的基因，并在此基础上培育和推广高抗病虫害的品种。然而，常规抗病虫育种方法容易受环境因素的影响，对表型选择不准确，从而导致育种效率低。分子标记辅助选择(Molecular Marker-assisted Selection, MAS)育种不受外界因素影响，利用与目标基因紧密连锁(或基因内)的标记，对目标单株进行标记基因型鉴定，结合农艺性状进行筛选，可以有效提高育种效率、缩短育种周期，常用于连续回交育种对受体的目标性状进行定向改良，是现代分子育种的重要手段[4]。利用MAS技术聚合高抗褐飞虱和稻瘟病的基因，培育新的多抗品种，对水稻生产具有重要意义。【前人研究进展】近年来，随着分子生物学及生物信息学的发展，越来越多的水稻抗褐飞虱基因被定位克隆，至今已有35个抗褐飞虱基因被鉴定，其中66.6 %的基因分布在第4号和第12号染色体上，29个基因被定位于水稻7条染色体的不同区域。目前，已经被克隆的褐飞虱抗性基因有位于水稻第4号染色体上的Bph3[5]和Bph6[6]、位于第12号染色体上的Bph9[7]、位于第3号染色体长臂端的Bph14[8]、位于第12号染色体长臂的Bph18[9]和Bph26[10]以及位于第6号染色体的Bph29[11]、Bph32[12]和Bphi008a[13]。抗稻瘟病基因的研究也取得了较大进展，已经被鉴定和定位的抗稻瘟病基因超100个，这些基因成簇分布，大部分基因分布于第6、11和12号染色体上，少数基因分布在除第3和11号染色体外的其他染色体上。在定位的主效基因中，Pi1[14]、Pi2[15]、Pi9[16]、Pigm[17]、Pid3[18]、Pizt[15]、Pi56[19]、Pia[20]、Pib[21]、Pita[22]等26个抗稻瘟病基因已被成功克隆，并广泛应用于抗病育种中。【本研究切入点】目前市场推广的主要水稻品种中，抗褐飞虱的品种为数不多，聚合抗褐飞虱和抗稻瘟病基因的品种更少，培育的品种大多为单基因抗性品种，专一性较强，难以满足生产需求。为了防范单基因抗病虫害品种大面积、长时间种植后出现抗性丧失问题，有必要进一步拓宽抗病虫基因的材料基础，鉴定克隆出抗谱不同的抗病虫基因[23]。【拟解决的关键问题】通过杂交、回交和自交，结合MAS技术和抗病虫性鉴定，将Pi9导入本身含有褐飞虱抗性基因Bph14和Bph15的优异恢复系桂恢1561中，从中选育出聚合Bph14、Bph15和Pi9基因的既抗褐飞虱又抗稻瘟病的优质恢复系中间材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

轮回亲本为含Bph14和Bph15双抗褐飞虱纯合基因的恢复系材料桂恢1561(来源于以IR24 为受体亲本的小粒野生稻基因导入系，由本研究组自主选育完成)[24]；抗病供体亲本为恢复系材料桂99+Pi9(来源于桂99/IR75-1-172，由湖北农业科学院戚华雄老师提供)；稻褐飞虱感虫对照TN1，抗虫对照RH，抗虫鉴定的稻褐飞虱捕捉于广西农业科学院水稻研究所的试验田中，于玻璃温室中培养约3个世代作为接种虫源。

1.2 试验方法

1.2.1 基因聚合育种流程 以抗褐飞虱恢复系桂恢1561为轮回亲本，桂99+Pi9为父本进行杂交、2次回交及2次自交；从BC1F1世代开始对回交后代进行MAS，从分离群体中选出含抗稻瘟病基因Pi9的植株继续与轮回亲本进行回交；自交2次后选择Bph14、Bph15和Pi93个抗性基因都纯合、农艺性状优良的株系用于褐飞虱苗期抗性鉴定及稻瘟病田间自然诱发抗性鉴定(图1)。

1.2.2 分子标记 所筛选的与褐飞虱抗性基因Bph14、Bph15紧密连锁的多态性分子标记分别为MRG2329和MS5[25]，稻瘟病抗性基因Pi9的特异性标记为M-Pi9[26]。3对引物均为共显性标记，由华大基因合成。由于本研究中所用的轮回亲本为抗虫亲本桂恢1561，所以在回交选育的过程中没有对抗虫基因Bph14和Bph15进行标记检测，标记MRG2329、MS5用于BC2F2群体中检测选择Bph14、Bph15基因纯合单株。

图1 MAS改良桂恢1561抗性技术路线Fig.1 The technical approach of improving blast resistance of Guihui1561 by MAS

表1 水稻苗期褐飞虱抗性鉴定评价标准

Table 1 Evaluation standard of screening resistant varieties to rice brown planthopper

抗性级别Resistance grade description死苗率(%)Death rate抗性水平Resistance0≤1.0免疫11.0～10.0高抗310.0～30.0抗530.0～50.0中抗750.0～70.0中感9≥70.0感

1.2.3 PCR反应体系和反应程序 采用改良CTAB法提取水稻幼嫩叶片DNA。PCR反应总体积为15 μl，其中DNA 模板2 μl，2×TaqPCR Master Mix 6 μl，10 nmol/L 的正反向引物各0.5 μl，加ddH2O补足15 μl。引物MS5的PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min后进行35个循环扩增，循环条件为94 ℃变性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸45 s，循环结束后再72 ℃延伸5 min，反应结束后体系于4 ℃保存；引物MRG2329和M-Pi9的PCR反应程序退火温度为58 ℃，其他条件与MS5相同。MRG2329和MS5的PCR扩增产物在浓度为8 %的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，银染，保鲜膜包胶保存并记录结果。在M-Pi9的PCR 扩增产物中加入核酸染料，用浓度为2 %的琼脂糖凝胶进行电泳分离，于凝胶成像系统中拍照并记录结果。

1.2.4 褐飞虱苗期抗性鉴定 采用苗期集团法进行褐飞虱抗性鉴定，在广西农业科学院植物保护研究所进行。试验材料为桂恢1561、桂99+Pi9、RH、TN1以及改良恢复系BC2F3的GH18-1、GH18-7、GH18-10、GH18-18株系。种子浸种催芽后，播于塑料方盆(52 cm×35 cm×8 cm)中，每个秧盘中间播抗感对照RH和TN1，每盘播4个材料，每个材料播3行，每行25粒，设2次重复。当秧苗长到二叶一心时，剔除弱苗和死苗，按5头/株的虫量接入2～3龄的褐飞虱若虫，在感虫对照品种TN1死苗率达到95 %时，统计各株系的死苗率及抗性级别(表1)。

1.2.5 稻瘟病自然诱发抗性鉴定 自然诱发病圃设在稻瘟病多发区广西岑溪市梨木镇高围村，面积约0.7 hm2。病圃常年处于高温、高湿的气候环境中，具有利于发病的地理环境条件，历年稻瘟病发生严重。病圃全生育期不喷杀菌剂，杀虫剂的使用量根据病圃虫害发生的程度而定。共进行2次病情调查：移栽前的苗叶瘟调查和黄熟期的穗颈瘟调查。苗叶瘟调查在每个株系的发病中心选择有代表性的病丛，以发病最重的20～50张叶片平均发病等级作为该株系的抗性级别；穗颈瘟调查每小区至少100穗。田间的栽培管理、调查方法、病级划分、记载标准和抗性评价按颜群等[27]的水稻品种试验抗性鉴定方法与标准执行。抗性综合指数=苗叶瘟病级×25 %+穗颈瘟发病率病级×25 %+穗颈瘟损失率病级×50 %。

1.2.6 农艺性状考察 2018年2月下旬播种，3月下旬移栽，于大田种植试验材料，每个材料种植2行，每行10株，正常水肥管理，于成熟期进行农艺性状考察。每个材料选择中间8株，考察性状，主要包括株高、生育期、单株有效穗数、穗长、每穗粒数、结实率及千粒重等，取平均值为其表型值。

2 结果与分析

2.1 亲本间的多态性检测

由图2可知，MRG2329在桂恢1561中扩增出的产物片段较大，在桂99+Pi9中扩增出的产物片段较小；MS5和M-Pi9的产物扩增结果与MRG2329相同。3对引物的PCR产物均在亲本间有明显多态性，可用于该育种群体各世代中的分子标记检测。

A-M：分子量标准；1、3：抗虫亲本桂恢1561；2、4：感虫亲本桂99+Pi9；B-M：分子量标准；1：抗病亲本桂99+Pi9；2：感病亲本桂恢1561A-M: DNA Marker; 1, 3: Resistance parent Guihui1561; 2, 4: Susceptible parent Gui99+Pi9; B-M: DNA Marker 1: Resistant parent Gui99+Pi9; 2: Susceptible parent Guihui1561图2 引物MRG2329、MS5和M-Pi9在亲本间的多态性鉴定结果Fig.2 Identification of polymorphism among parents using primers MRG2329, MS5 and M-Pi9

M：分子量标准；1：抗病亲本桂99+Pi9；2：感病亲本桂恢1561；3～12：BC1F1单株M: DNA Marker 1: Resistant parent Gui99+Pi9; 2: Susceptible parent Guihui1561; 3-12: BC1F1 population图3 引物M-Pi9对BC1F1的单株筛选Fig.3 Screening of BC1F1 by primer M-Pi9

1：抗虫亲本桂恢1561；2：改良株系; TN1：感虫对照；RH：抗虫对照；9：托盘编号1: Resistance parent Guihui1561; 2: GH18-1 Improved lines GH18-1; TN1: Susceptible CK; RH: Resistance CK; 9: Tray number图4 苗期集团法鉴定褐飞虱抗性Fig.4 Identification of resistance to brown planthopper by seedling group method

2.2 分离世代的单株检测

恢复系回交改良过程中选择保留含Pi9抗性基因且农艺性状优良的单株进行回交。在BC1F1群体中，共检测了20个单株，其中有9个单株含Pi9杂合基因，部分检测结果见图3(6、7、8、10、11和12为含目标基因的杂合体)。在BC2F1群体中共检测了20个单株，其中含Pi9合基因的有8株，混收获得BC2F2。大区种植BC2F2，并利用分子标记MRG2329、MS5和M-Pi9对单株进行检测，共检测到17株含3个抗性基因的纯合单株，从中筛选获得GH18-1、GH18-7、GH18-10、GH18-18等4个农艺性状与桂恢1561相近的改良恢复系单株。

2.3 亲本及改良株系的褐飞虱及稻瘟病抗性鉴定与比较

2次褐飞虱苗期抗性鉴定结果表明，感虫亲本桂99+Pi9对褐飞虱的抗性为中感，而抗虫亲本桂恢1561的抗性略低于抗性对照RH；桂恢1561改良株系GH18-1、GH18-7、GH18-10、GH18-18均达到抗级水平，4个株系之间抗性区别不大，其中抗性最好的是GH18-18(表2，图4)。

在2018年上半年对鉴定材料进行了苗叶瘟抗性鉴定和黄熟期穗颈瘟抗性鉴定。与亲本桂恢1651相比，改良株系GH18-18稻瘟病抗性明显提高，穗颈瘟抗级达到3.8级；轮回亲本桂恢1561对稻瘟病抗性综合指数为6.8级，抗性评价为感，桂恢1561的4 个改良株系抗性综合指数均在4级以下，抗性评价为抗，其中抗性表现最好的是GH18-7(表3，图5)。综合褐飞虱及稻瘟病抗性鉴定结果，桂恢1561改良株系GH18-1、GH18-7、GH18-10、GH18-18既抗褐飞虱又抗稻瘟病。

2.4 亲本及改良株系的农艺性状评价与比较

如表4所示，与轮回亲本相比，4个改良株系的3个农艺性状得到了不同程度的改良，主要表现为生育期缩短，单株有效穗数增加，千粒重降低；除了GH18-18，其余3个株系的株高均比亲本桂恢1561高；穗长变短，每穗总粒数有2个株系较轮回亲本高，结实率都在80 %以上。结果表明，在含抗褐飞虱基因Bph14、Bph15的亲本桂恢1561中导入抗稻瘟病基因Pi9是可行的，对产量性状影响不大，部分农艺性状甚至优于轮回亲本。

表2 褐飞虱苗期抗性鉴定结果

表3 稻瘟病抗性鉴定结果

表4 正常水田条件下的农艺性状表现

图5 稻瘟病抗性鉴定Fig.5 Rice blast resistance identification

3 讨 论

当前，许多抗病虫基因已经被成功定位和克隆，且有一部分被广泛应用于抗性育种中，抗病虫的水稻品种培育也取得了一定进展。根据分子设计育种的原理与要求，通过MAS技术进行基因聚合，将不同的抗病虫基因相组合将会为新育成水稻品种提供更加稳定和持久的抗性[28]。

利用MAS技术聚合水稻抗性基因的研究成果颇丰，一些水稻新品系已成功选育，且部分品种(组合)已经通过审定。倪大虎等[29]利用MAS技术将Xa23和Pi9基因聚合在一起，聚合系既抗白叶枯病又抗稻瘟病，抗性和抗谱均与亲本相当。Liu等[30]利用MAS技术将2个抗褐飞虱基因Bph3和Bph27(t) 导入易感品种Ningjing 3中，得到的聚合系在很大程度上提高了对褐飞虱的抗性，避免了由于褐飞虱影响而造成的产量损失。李进波等[24]以GD-7为稻瘟病抗性基因供体、扬稻6号为受体，通过回交转育结合MAS，选育出10个双基因(Pi1和Pi2)纯合且农艺性状优良的水稻新品系。Xiao等[31]将抗白叶枯病基因Xa23以及抗褐飞虱基因Bph14和Bph15通过分子标记辅助回交策略导入恢复系华占中，不仅提高了华占的抗性，而且改良后水稻的产量也有所增加。孙富等[32]以含广谱稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2的材料BL122为供体亲本，红色特种籼稻桂红一号为受体亲本，通过杂交、回交和自交并结合MAS技术，将Pi1和Pi2基因导入桂红一号中，获得了携带2个抗性基因的高抗稻瘟病改良材料。

然而，目前已成功选育和推广的水稻品种中，抗褐飞虱的品种仅占少数，聚合抗褐飞虱基因和抗稻瘟病基因的品种更少。本研究组自2012年起在广西岑溪市建立了稻瘟病鉴定点，综合几年的试验结果，发现含Pi9基因的材料田间抗性表现最好。优质恢复系桂恢1561具有抗褐飞虱、综合农艺性状优良、配合力好等优点。本研究以桂恢1561为轮回亲本，与稻瘟病抗性材料桂99+Pi9进行杂交和回交，通过稻瘟病和褐飞虱抗性鉴定及评价，结合分子标记辅助选择技术，筛选出了一批与轮回亲本桂恢1561遗传背景相近且含Bph14、Bph15和Pi9双抗病虫害纯合基因的材料。在本研究成果的基础上，本研究组将继续开展以下育种实践：继续种植4个改良株系材料，系选使其农艺性状稳定；用双抗病虫害的稳定恢复系与生产上骨干三系不育系广泛测优配组，培育抗病虫害强优组合，加快生产应用。

4 结 论

通过常规回交育种、分子标记辅助选择和抗病虫鉴定相结合的方法，筛选获得了4份聚合褐飞虱抗性基因(Bph14和Bph15)和稻瘟病抗性基因Pi9的水稻病虫害双抗中间材料，为选育新的双抗恢复系提供种质资源。