“一测多评”法在银翘散质量控制中的应用*

张敏， 刘莉， 王洪凤， 孟小夏， 王鹏娇， 高秀丽**

(1.贵州医科大学 药学院， 贵州 贵阳 550025; 2.贵阳德昌祥药业有限公司， 贵州 贵阳 550002)

银翘散出自清代医学家吴瑭《温病条辩》，被称为“辛凉平剂”，该方由金银花、连翘、薄荷、牛蒡子、荆芥穗、淡豆豉、芦根、淡竹叶、桔梗和甘草十味中药组成，在临床上广泛用于治疗外感风寒，发热头痛，咽喉疼痛等[1-3]，亦被收载于《中国药典》2015年版中。《中国药典》2015年版中银翘散仅以方中牛蒡子中牛蒡苷作为含量测定控制指标[4]，但处方中又以金银花、连翘为君药，入药量较大，因此仅以牛蒡苷单一成分的含量测定不足以较好地控制本品质量。用常规方法测定多个成分含量来评价药品的研究已有报道[5-7]，但这些方法存在着对照品消耗量大，操作复杂及繁锁的缺陷。因此，本实验引入“一测多评”法对银翘散进行多指标的质量控制，以牛蒡苷为内参物，通过建立其与绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷的相对校正因子进行含量计算，探讨一测多评法在银翘散质量评价中应用的可行性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 高效液相色谱仪，赛默飞UltiMate3000高效液相色谱仪，Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Thermo SyncronisC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，TB-215D型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；SG8200H型超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)。银翘散购于贵州德昌祥药业有限公司，牛蒡苷(批号120903-201109)，绿原酸(批号110753-201415)，连翘苷(批号110821-201514)，连翘酯苷A(批号111810-201405)对照品均购于中国食品药品检定研究院，乙腈、甲醇为色谱纯，娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1色谱条件 色谱柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)梯度洗脱，线性洗脱程序为0～10 min，14%～15%A；10～20 min，15%～17%A；20～25 min，17%～24%A；25～30 min，24%～28%A；30～40 min，28%～32%；检测波长230 nm，流速1.0 mL/min；进样量10 μL，柱温30 ℃，分析时间40 min。上述色谱条件下，各组分分离度良好。

1.2.2混合对照品溶液制备 分别取牛蒡苷、绿原酸、连翘苷以及连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加80%甲醇制备成浓度分别为309，344、452、76 mg/L的混合对照品溶液。

1.2.3供试品溶液制备 取银翘散样品适量(约0.5 g)，精密称定，精密加人80%甲醇25 mL置具塞锥形瓶中、密塞、称定重量，超声处理(功率500 W，频率59 kHz)30 min，放冷后再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量、摇匀、过滤，取续滤液。

1.2.4阴性样品溶液制备 按银翘散处方比例(金银花100 g、连翘100 g、桔梗60 g、薄荷60 g、淡豆豉50 g、淡竹叶40 g、牛蒡子60 g、荆芥40 g、芦根100 g和甘草40 g)，分别制得不含金银花、连翘、牛蒡子的阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液，结果见图1。

2 结果

2.1 线性关系考察

按“1.2.2”项下制备混合对照品溶液，以80%的甲醇逐级稀释得线性关系考察所需的系列混合对照品溶液，按“1.2.1”项下的色谱条件，分别进样，测定峰面积。以各对照品峰面积(y)对其相应的质量浓度(x)进行线性回归，得到各对照品的回归方程，见表1，结果显示，相关系数(r)≥0.999 1，各对照品在相应的浓度范围内线性关系良好。

2.2 校正因子计算

分别精密吸取“1.2.2”项下制备各质量浓度混合对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下，进样测定，按公式fk/m=fk/fm=(Wk×Am)/(Wm×Ak)(Ak为内参物峰面积，Wk为内参物的质量或浓度，Am为其他组分m的峰面积；Wm为其他组分m的质量或浓度)[8]，以牛蒡苷为内参物，分别计算其对绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷的相对校正因子f，见表2。

2.3 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液10 μL连续进样6次，记录4种成分保留时间及峰面积，结果牛蒡苷，绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷的峰面积(RSD)分别为1.23%，2.22%，0.89%，2.51%，均小于3%，表明精密度良好。

2.4 重复性试验

分别取银翘散粉末约0.5 g、共6份，精密称定，按1.2.3项下制备供试品溶液。结果显示，绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷及牛蒡苷的平均质量分数分别为0.73%、1.42%、0.19%及0.87%；绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、牛蒡苷的RSD分别为1.55%，1.67%，2.34%，1.02%，均小于3%，说明该方法的重复性良好。

注：1为绿原酸，2为连翘酯苷A，3为连翘苷，4为牛蒡苷；A为混合对照品,B为银翘散样品，C为金银花阴性，D为连翘阴性，E为牛蒡子阴性图1 混合对照品、供试品及阴性样品的HPLC结果Fig.1 HPLC of mixed reference substances, Yinqiaosan sample, and negative samples

表1 银翘散中4种成分的线性回归方程及其线性范围Tab.1 Linear regression equations and linear range of the components

表2 银翘散中3种成分相对牛蒡苷的校正因子Tab.2 Relative correction factors of four constituents in Yinqiaosan

2.5 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液10 μL，于0，2，4，8，12，24 h分别进样，记录保留时间及峰面积。结果绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷及牛蒡苷的峰面积RSD分别为1.28%、1.19%、2.04%及0.98%，均小于3%， 说明样品溶液在24 h内稳定。

2.6 加样回收率

精密称取已知含量的银翘散0.25 g，共6份，加入一定量对照品溶液，按1.2.3项下方法制备供试品溶液，按1.2.1项色谱条件进行测定。结果显示，银翘散中绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A和牛蒡苷回收率分别为100.6%、100.6%、99.52%和99.88%，RSD均小于3.0%，说明此方法能够准确测定银翘散中4种指标性成分的含量。

2.7 校正因子重复性考察

试验分别考察了Agilent 高效液相色谱仪及Thermo UltiMate3000高效液相色谱仪两种色谱系统和Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)及Thermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)两种色谱柱，所得的相对校正因子见表3。结果显示，相对校正因子在不同的仪器及不同的色谱柱下具有良好的重现性。

表3 不同仪器和不同色谱柱测得相对校正因子Tab.3 Different instruments and columns measured relative correction factor

2.8 待测组分色谱峰的定位

建立QAMS法的目的是只使用一种对照品即牛蒡苷，来实现对绿原酸、连翘酯苷A以及连翘苷3种成分的同步测定。本文采用各待测成分相对于牛蒡苷的相对保留值作为色谱峰定位标准，考察了其在不同品牌高效液相色谱仪和不同色谱柱上的重复性，结果表明在不同仪器和不同色谱柱下，各成分间相对保留值变化不大，RSD在0.30%～4.3%，见表4。因此，本研究选用相对保留值作为目标色谱峰的定位指标较为合适。

2.9 样品测定

取银翘散样品，共计10批次，分别按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，记录绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷和牛蒡苷的色谱峰峰面积，分别采用外标一点法(ESM)和一测多评法(QAMS)，计算银翘散中4种成分的含量，并对两种方法测定结果进行比较(表5)，两种方法的相对偏差均在3%以内，说明一测多评法用于银翘散进行多指标成分的质量评价是可行的。

表4 不同仪器和色谱柱测得的相对保留值Tab.4 Relative retention time of different instruments and columns

表5 ESM及QAMS样品测定结果比较(n=3)Tab.5 Determination of samples

3 讨论

银翘散作为一直沿用至今的中医经典方剂，具有良好的解热、镇痛、抗炎、抗菌等功效，临床上也被广泛用于治疗流行性感冒、急性扁桃腺炎、咽喉炎、肺炎、疱疹、麻疹、流行性腮腺炎等病毒性感染疾病。但是，银翘散属于中药复方制剂，其质量控制成为一大难点。中药多成分、多功效的作用特点，决定着单一成分难以全面评价中药质量，因此，多成分多指标的含量测定成为当前国际上广泛认可的质量评价模式[9-11]。目前为止，采用外标法测定银翘散中单个或多个成分来评价其质量的研究已有很多报道，由于需要多种成分的定量测定，所以这些方法存在对照品消耗量大、成本高、操作繁琐等缺点。因此，本研究首次采用一测多评法测定银翘散中绿原酸、连翘苷、连翘酯苷A和牛蒡苷的含量。选用廉价易得的牛蒡苷对照品为内参物，建立银翘散中多指标成分定量的一测多评法。

本实验考察了不同仪器和不同色谱柱条件下的相对校正因子的重现性，结果表明各成分相对校正因子的重现性较好。对比外标一点法的定量测定结果，一测多评法计算所得含量与外标一点法测定所得实测值无显著性差异，说明本实验计算所得的相对校正因子可以用于银翘散中4种成分的定量测定。