云南汉族人群HLA-DM基因多态性与HCV慢性感染的相关性分析

陈珺， 杨瑾， 刘楠楠， 刘舒媛， 李传印， 张新文， 史荔， 张淑琼**

(1.中国医学科学院&北京协和医学院 医学生物学研究所 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室， 云南 昆明 650118; 2.昆明市第三人民医院， 云南 昆明 650041)

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C Virus，HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要经血液、性及母婴等途径传播。据世界卫生组织统计，全球每年的HCV感染率约为3%，到2015年感染人数约为7 100万，我国每年HCV感染率约为0.7%，感染人数高达987.5万[1]，丙型肝炎已成为严重的社会和公共卫生问题。慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)是HCV感染后，机体的免疫系统与病毒相互作用的结果，宿主抗原呈递相关基因在HCV的感染和转归中发挥着重要作用，人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)Ⅱ类分子与HCV感染的相关性已被多项研究证实[2-3]，且参与HLA Ⅱ类分子抗原呈递的HLA-DM分子的作用也受到重视。HLA-DM分子可以维持未结合抗原肽的HLA Ⅱ类分子的稳定，并对外源性抗原肽进行加工修饰，促进HLA Ⅱ类分子与抗原肽结合，并延长外源性抗原肽在抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)表面的暴露时间[4]。HLA-DM基因HLA的Ⅱ类基因区，分为HLA-DMA和HLA-DMB[5]。HLA-DMA和HLA-DMB基因在APC细胞的内质网中合成DMα链和DMβ链，并装配成异二聚体DM分子，然后转移到内体或溶酶体中发挥其功能[6]。HLA-DM基因与经典的HLA Ⅱ类基因类似，也存在多态性。目前HLA国际命名委员会确定的HLA-DMA基因和HLA-DMB基因分别有4个和7个，即DMA *01∶01～01∶04 和 DMB*01∶01～01∶07[7]。HLA-DM基因的多态性影响着DM分子的结构和功能，导致抗原呈递的差异，从而与自身免疫性疾病及感染性疾病的发生相关。已有研究报道，HLA-DM基因多态性与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)[8]，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)[9]，Ⅰ型糖尿病(type 1 diabetes，T1D)[10]等相关，但与感染性疾病的关系研究报道很少。因此本研究拟检测HCV慢性感染人群中HLA-DM基因的多态性位点，并对其进行分型，初步分析HLA-DM基因多态性与云南汉族人群HCV慢性感染的相关性。

1 对象与方法

1.1 样本收集

根据中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学分会2015年制定的《丙型肝炎防治指南》[11]诊治标准及“知情同意”原则，随机抽取在云南省某医院就诊的HCV慢性感染者185名作为病例组。通过临床和实验学检查，患者血清抗-HCV阳性， HCV RNA≥15 000 U/mL持续6个月以上，血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和(或)天冬氨酸转氨酶 (aspartate aminotransferase，AST)升高、肝脏病理学符合慢性肝炎表现，且患者未经抗病毒、保肝等治疗。排除合并慢性乙型肝炎等其他病毒性肝炎、非酒精性、脂肪性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝炎、失代偿性肝病、原发性胆汁性肝硬化、遗传代谢性肝病、肝脏血管病等其他肝病患者。随机抽取同时期正常健康个体180名为对照组，纳入标准为受试者血清抗HCV和HCV-RNA阴性，且血清ALT和AST水平正常。所有受试者均为居住于云南地区的彼此无血缘关系汉族个体，病例组男性91例、女性94例，对照组男性100例、女性80例。采集受试者空腹静脉血5 mL，用EDTA抗凝，按照Qiagen血基因组DNA提取试剂盒说明书提取外周血基因组DNA，于-20 ℃保存备用。

1.2 HLA-DM基因分型

根据IMGT数据库(https://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/ipd/imgt/hla/allele.cgi)中HLA-DM基因相关序列，选取10个SNP位点作为HLA-DMA和HLA-DMB基因的分型判断标准，所选位点均为HLA国际命名委员会命名HLA-DMA和HLA-DMB基因的特异性位点[7]，见表1和表2。分别用引物对HLA-DMA基因的第3外显子，HLA-DMB基因的第2外显子及第3外显子区域进行PCR扩增，扩增引物及扩增长度见表3。PCR体系包括，模板DNA 10 ng，正向和反向引物各10 pmol，TaKaRa PCR Mix 25 μL(含ExTaq聚合酶，dNTPs)，ddH2O 21 μL，反应总体系50 μL。PCR条件为98 ℃预变性5 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s(共30个循环)。PCR产物进行Sanger测序(测序引物同PCR扩增引物)以检测该区域中的多态性位点。对于有2个以上杂合位点的分型样本，进一步进行TA克隆测序，验证其位点多态性的连锁情况。

1.3 统计学方法

采用t检验比较病例组和对照组中的年龄、性别比例、肝功能指标等各项基本信息。使用Pypop[12]软件进行哈迪-温伯格平衡(hardy-weinberg equilibrium)检验，计算位点间的连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)，两位点间的LD关系用D′表示，D′>0.8认为位点间强连锁。统计病例组和对照组法人基因型频率及等位基因频率，构建HLA-DMA-DMB基因单倍型。采用卡方检验(χ2)对HLA-DM基因的基因型频率及单倍型在病例组和对照组之间的分布进行分析。单倍型频率的统计分析结果中，仅列其中频率大于0.02的单倍型，P<0.05认为差异具有统计学意义。对基因型频率的分析结果进行FDR(false discovery rate)校正，调整P<0.05认为差异具有统计学意义。

表1 HLA-DMA 基因第3外显子位点Tab.1 SNPs locus of exon 3 of HLA-DMA

表3 引物序列及片段大小Tab.3 Primer sequences for detecting HLA-DMA, HLA-DMB

2 结果

2.1 研究样本特征

病例组和对照组的年龄，性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)；病例组的ALT和AST水平显著高于对照组(P<0.05)，符合HCV慢性感染的诊断标准，见表4。

表4 两组研究对象基本特征Tab.4 Basic characteristics of the subjects

2.2 HLA-DMA及HLA-DMB各等位基因在病例组和对照组中的分布

HLA-DMA及HLA-DMB基因的基因型分布均符合哈迪-温伯格平衡(P>0.05)。HLA-DMA，HLA-DMB各等位基因在病例组和对照组中的分布见表5，经FDR校正后差异无统计学意义(调整P>0.05)。在病例组及对照组中共检出4种HLA-DMA等位基因DMA*01∶01、DMA*01∶02、DMA*01∶03及DMA*01∶04，5种HLA-DMB等位基因DMB*01∶01、DMB*01∶02、DMB*01∶03、DMB*01∶05及DMB*01∶07。分布频率最高的HLA-DMA基因的等位基因为DMA*01∶01，在病例组和对照组中频率分别为0.719和0.672；其次是DMA*01∶02，在病例组和对照组中频率分别为0.249和0.306。分布频率最高的HLA-DMB基因的等位基因为DMB*01∶01，在病例组和对照组中频率分别为0.489和0.544；其次是DMB*01∶03，在病例组和对照组中频率分别为0.311和0.258。

表5 两组HLA-DMA及HLA-DMB各等位基因频率比较Tab.5 Comparison of allele frequencies of HLA-DMA and HLA-DMB genes in case group and control group

2.3 HLA-DMA -DMB单倍型频率在病例组和对照组中的分布

在病例组和对照组中，频率大于0.02的单倍型共有6种，结果见表6。在病例组及对照组中，分布频率最高的HLA-DMA单倍型为DMA*01∶01-DMB*01∶01、在病例组和对照组中的频率分别为0.260和0.322，其次为DMA*01∶01-DMB*01∶03、在病例组和对照组中的频率分别为0.287和0.197。单倍型DMA*01∶01-DMB*01∶03在病例组中的频率显著高于对照组(0.287vs 0.197，OR=0.134，95%CI为1.529～2.305，P=0.005)，单倍型DMA*01∶02-DMB*01∶03在病例组中的频率显著低于对照组(0.024 vs 0.056，OR=0.424，95%CI为0.194～0.944，P=0.031)。

表6 两组HLA-DMA-DMB单倍型频率比较Tab.6 Comparison of haplotype frequencies of HLA-DMA-DMB in case group and control group

3 讨论

病毒的免疫逃逸及宿主的免疫保护力低下是造成HCV慢性感染的两个主要原因，研究表明，HCV慢性感染者的免疫反应能力明显减弱，HCV急性感染后特异性抗体反应明显延迟[13]，体内CD4+T细胞和CD8+T细胞反应明显降低[14]。HLA分子可影响抗原肽的呈递，影响宿主的抗病毒免疫应答，从而影响HCV感染的临床结局[2,15]。HLA-DM分子作为HLA-Ⅱ类分子的分子伴侣在抗原呈递的过程中发挥重要作用，当DM分子缺失时，机体不能形成稳定的MHC-Ⅱ类分子-抗原肽复合物[16]。HLA-DM基因多态性导致HLA-DM分子构象和功能的差异，从而影响抗原的呈递效率，因此该基因是疾病易感性研究过程中的重要靶标[4]。Huang等[17]的研究表明，HLA-DMA基因的rs1063478 T在HCV慢性感染组中的频率显著低于健康对照组(0.025 vs 0.177，OR=0.160，95%CI为0.08～0.30，P=0.020)，显著降低了HCV感染的风险。进一步研究表明，rs1063478 TT基因型的HCV患者具有较强的病毒持续应答，从而影响聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗HCV的疗效[18]。本研究结果显示，rs1063478(codon140)在HCV慢性感染组中等位基因T的频率为0.257，健康对照组中的频率为0.292，两者的分布差异无统计学意义(P>0.05)。

目前，DM基因多态性与疾病的关联研究集中于自身免疫性疾病的研究。构象分析表明，与DMA*01∶01相比，DMA*01∶03等位基因的氨基酸序列发生了G155A，R184H突变，这两个位点是DM分子与HLA-Ⅱ类分子作用的关键位点，其改变影响了HLA-Ⅱ类分子与抗原肽结合的结合力，有助于延长抗原肽的暴露时间，从而增加了自身免疫性疾病的易感性[19]。因此，无论在RA还是T1D的研究中均表明：DMA*01∶03在RA患者中的频率显著增高 (0.263 vs 0.042，OR=9.00，95%CI为1.10～73.7，P=0.014)；在T1D患者中的频率也显著高于对照(0.500 vs 0.080，P<0.05)[1]。此外，在T1D的关联研究中发现，DMA*01∶02的表型频率在德国患者(0.120 vs 0.289，P<0.01)[20]及中国患者中均显著降低(0.108 vs 0.420，P<0.001)[19]。DMA*01∶02与DMA*01∶03与T1D的相关性不同，对其氨基酸序列分析显示，DMA*01∶02的140、155、84位氨基酸分别为I、G、R，而DMA*01∶03为V、A、H，提示其氨基酸序列的改变可能是原因之一。在本研究中，DMA*01∶02在病例组的频率较低(0.249 vs 0.306)，但差异无统计学意义(P>0.05)，单倍型统计结果显示DMA*01∶02-DMB*01∶03在病例组中的频率显著低于对照组(0.024 vs 0.056，OR=0.424，95%CI为0.194～0.944，P=0.031)，提示DMA*01∶02-DMB*01∶03可能是HCV慢性感染的保护性单倍型。

HLA-DMB基因多态性的研究中，DMB*01∶01的表型频率在T1D患者中显著降低，德国人群[21]中为(0.706 vs 0.978，P<0.05)，中国人群[11]中为(0.486 vs 0.736，P<0.05)，而DMB*01∶03在患者中显著增高，表型频率分别为(0.284 vs 0.045，P<0.001)和(0.429 vs 0.218，P<0.05)。与DMB*01∶01相比，DMB*01∶03等位基因的氨基酸序列仅发生了I179T突变，而这两个等位基因在T1D中的作用却相反，提示该位点可能是DM分子作用的关键位点。然而，在RA的关联研究中，DMB*01∶03在法国RA患者中的表型频率显著增高(0.183 vs 0.040，P=0.004)[9]，但在美国白人RA患者中的研究结果却与之相反，DMB*01∶03表型频率显著降低(0.202 vs 0.445，P<0.05)[21]。本研究中，DMB*01∶03在病例组中的频率较高(0.311 vs 0.258)，但差异无统计学意义(P>0.05)，而单倍型频率DMA*01∶01-DMB*01∶03在病例组中的频率显著高于对照组(0.287 vs 0.197，OR=1.634，95%CI为1.159～2.305，P=0.005)，提示DMA*01∶01-DMB*01∶03可能是云南汉族人群HCV慢性感染的易感单倍型。

本研究中，HLA-DMA，DMB分布与Feng等[22]报道的中国汉族群体研究结果一致，DMA*01∶01，DMA*01∶02最为常见，等位基因频率分别为0.694和0.280；同样，DMB*01∶01，DMB*01∶03在中国汉族群体中最为常见，等位基因频率分别为0.525和0.316。然而，HLA-DM基因在中国汉族群体中的分布与美国白人，意大利人存在显著差异，比如 DMB*01∶03位点在中国人群中的等位基因频率为0.316，显著高于美国白人(0.196)及意大利人(0.020)[23-25]，提示遗传背景的差异可能导致关联分析的结果不同。且本研究的样本量较少，后续应该扩大样本量对HLA-DM基因与云南汉族人群HCV慢性感染的关系进行进一步的验证。

综上，本研究结果表明，HLA-DMA，DMB等位基因频率在病例组与对照组中的分布无显著差异，但单倍型DMA*01∶01-DMB*01∶03在病例组中的频率高于对照组，单倍型DMA*01∶02-DMB*01∶03在病例组中的频率显著低于对照组，提示HLA-DM基因单倍型DMA*01∶02-DMB*01∶03，DMA*01∶02-DMB*01∶03可能与云南汉族人群中HCV的慢性感染相关。