Cu和Pb对赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)生长的影响

邓紫云，陈清香,2,*

1. 广东海洋大学海洋与气象学院，湛江 524088 2. 广东省近海海洋变化与灾害预警重点实验室，湛江 524088

随着经济迅速发展，大量的重金属通过各种途径进入海洋，成为当前海洋的重要污染物。根据国家环境总局资料公布，我国相当一部分近海海水中的重金属浓度已超过国家一类海水水质标准(GB3097—1997)，有些污染严重的海区已经超过国家二类海水水质标准近2倍。

由于种类和浓度不同，重金属对海洋生态系统产生的影响差别较大；对生长周期短的浮游植物的生长、分布和群落结构都会产生较大影响，尤其是赤潮藻类的变化对海域生态环境会造成严重的影响。

赤潮异弯藻(Heterosigmaakashiwo)是一种鱼毒性藻类，具有极强的溶血性，对鱼类、贝类都有强毒性[1-2]。赤潮异弯藻在世界上多个海湾或河口都有形成赤潮的记录，学者对该赤潮藻种的生态、生理和分子生物学等多方面都进行了研究[2-11]。赤潮异弯藻的生理特征和毒性，使其能在全球范围内广泛分布并对生态造成严重影响。此藻在10～30 ℃内均能生长[5-6]，且在25 ℃生长最佳[7]，生长速率最高，能达到的藻密度最高；能适应的盐度为10～35[5]，最适盐度范围为20～25[7]，低盐(10)条件下藻生长速率最低[8]；太阳辐照度对藻的光合作用有显著影响[9]，光照周期为18 L∶6 D周期时生长最好[10]。N为37.5～225.0 mg·L-1、P为5.0～50.0 mg·L-1，且N/P达到25时最适合赤潮异弯藻生长[11]。

有关重金属对赤潮异弯藻的研究也已有报道。较高浓度的Cu对赤潮异弯藻有明显的抑制效果[12]，Cu浓度为0.5 mg·L-1时，Cu能明显抑制赤潮异弯藻的生长，超过此浓度时藻种基本不能存活；Pb在较低浓度(≤0.5 mg·L-1)时，能促进赤潮异弯藻生长；浓度为1.0～5.0 mg·L-1范围中，Pb表现出一定的毒性；当浓度达到10.0 mg·L-1时，藻的生长受到明显的抑制作用[13]。但2种重金属同时胁迫赤潮异弯藻的实验还未见报道，而近岸环境中重金属污染加剧，且是多种重金属元素同步增加，因此研究多种重金属共同影响赤潮异弯藻的结果更有利于环境预警。本实验选择Cu和Pb 2种重金属同时作用于赤潮异弯藻，以期了解多种重金属对微藻的共同作用效果。

随着湛江湾周边的大型钢铁、石化和造纸业的蓬勃发展，加上地形导致的湾内外水体交换较弱，污染物停留在湾内的时间较长，必定会对湛江湾的生态环境产生影响。重金属、营养盐等多种因子对浮游植物的影响尤为迅速且复杂，重金属的种类和浓度以及营养盐的浓度不同组合，对浮游植物的群落结构会产生不同影响。根据生态效应浮游植物可以分为饵料藻和赤潮藻，诱发无毒的饵料藻或有毒的赤潮藻旺发，对海洋环境会产生截然不同的生态效应，赤潮异弯藻是近年来在调查湛江湾时发现的有潜在危害的藻种，赤潮异弯藻的营养需求或对单种重金属敏感浓度都已有一些报道，但多种因子共同作用的影响还未见报道。因此，本研究拟在N、P营养盐浓度较高且稳定的条件下，研究2种常见重金属Cu和Pb单独或共同作用时，对赤潮异弯藻生长的影响，从而为预测湛江湾实测环境因子诱发赤潮异弯藻旺发的可能性提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

赤潮异弯藻购买自上海光语生物科技有限公司，用f/2营养液在室内常温条件下培养，光源为日照漫射光，在整个培养过程中，所使用的仪器均进行高温灭菌(120 ℃, 45 min)，实验操作过程均在超净工作台进行，器皿使用前进行30 min紫外灭菌。

仪器包括光学显微镜(Olympus BX53)、超净工作台(VS-1300U)、高压蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-50S)、电子天平(Sartoriu BT125D)等。试剂包括分析纯CuSO4·5H2O、分析纯Pb(NO3)2；培养液配制试剂有NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3·H2O、Na2EDTA、FeCl3·6H2O；人工海水配制试剂：(A液)NaCl、KBr、Na2SO4、H3BO3、KCl、NaF、NaHCO3，(B液)MgCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、SrCl2·6H2O。

1.2 铜和铅对赤潮异弯藻生长影响实验

将赤潮异弯藻细胞逐步加入f/2人工海水培养基培养至指数生长期，正式开始试验前将藻细胞进行饥饿3 d处理。实验时用人工海水将藻液稀释，使赤潮异弯藻的起始细胞密度约为5×104cell·mL-1，仅添加N=75 mg·L-1、P=5 mg·L-1作为营养元素，N/P=25，混匀分装后，另外加入已配制好的不同浓度的Cu和Pb(采用分析纯CuSO4·5H2O、Pb(NO3)2配制)进行实验。第一个实验中，Cu的浓度系列为0、0.02、0.1、0.5、2.5 mg·L-1；Pb的浓度系列为0、0.04、0.08、0.16、0.32 mg·L-1。第二个实验中，Cu的浓度系列为0、0.02、0.1、0.25、0.5 mg·L-1；Pb的浓度系列为1、3、5、7、9 mg·L-1。2个都是全因子实验，每个实验共25组，设置2个平行。

1.3 数据统计与分析

在显微镜下计算细胞密度，重复计数3～4次。将计数的藻细胞数用Excel初步处理，算出最大生长密度及生长周期，再根据公式计算细胞比生长速率：

μ=2.303(lgNt-lgN0)/(t-t0)

式中：Nt、N0分别表示t、t0时刻的细胞密度[11]。

将3个参数指标用SPSS 19.0进行方差分析，并采用Origin Pro进行画图。

2 结果(Results)

2.1 Cu和Pb对赤潮异弯藻生长的影响

在Cu和Pb的共同作用下，赤潮异弯藻生长情况发生改变。如图1，在Pb浓度相同时，不同浓度的Cu对藻细胞密度有影响。Cu为0.02 mg·L-1的藻细胞生长曲线与0 mg·L-1的趋势相似，且有一定的促生长作用，但当Cu浓度大于0.02 mg·L-1时，对藻生长有明显的抑制作用，高于0.5 mg·L-1时，藻细胞全部死亡。从图2可以看出，在Cu浓度相同的条件下，不同Pb浓度的藻生长趋势相似，表明Pb浓度在0～0.32 mg·L-1范围内时，对藻细胞密度影响差异不大。Pb在0～0.32 mg·L-1范围内，随着浓度的增加，对赤潮异弯藻有一定促进作用。但当铜浓度达到0.5 mg·L-1时，完全掩盖了低浓度Pb对赤潮异弯藻生长的促进作用。

在高Pb浓度下(图3)，Cu在0～0.1 mg·L-1的范围内的赤潮异弯藻生长趋势相似，随着Cu浓度的增加对赤潮异弯藻有一定的促生长作用。这与在低浓度Pb条件下的Cu对赤潮异弯藻有促生长效果的范围不一样，这可能是Cu和Pb之间存在拮抗作用。当Cu浓度在0.25～0.5 mg·L-1时，对藻生长有明显的抑制作用逐步增加，直至死亡。从图4可以看出，在不同的Cu浓度下，高浓度Pb对赤潮异弯藻生长有一定的影响。与低浓度Pb对比，在高浓度Pb条件下，藻细胞密度明显降低，表明Pb在1～9 mg·L-1时对赤潮异弯藻有一定的毒性，且随着Pb浓度的增加抑制作用增强，Pb为9 mg·L-1时抑制作用最明显。

图1 Pb低浓度时不同浓度Cu对赤潮异弯藻生长的影响Fig. 1 Effects of different concentrations of Cu on the growth of Heterosigma akashiwo at low Pb concentrations

图2 Cu浓度不同时低浓度Pb对赤潮异弯藻生长的影响Fig. 2 Effect of low concentration of Pb on the growth of Heterosigma akashiwo in different concentrations of Cu

图3 Pb高浓度时不同浓度Cu对赤潮异弯藻生长的影响Fig. 3 Effects of different concentrations on the growth of Heterosigma akashiwo at high Pb concentration

图4 Cu浓度不同时高浓度Pb对赤潮异弯藻生长的影响Fig. 4 Effect of high concentration of Pb on the growth of Heterosigma akashiwo in different concentrations of Cu

总之，低浓度的Cu(0～0.02 mg·L-1)和Pb(0～0.32 mg·L-1)能促进藻细胞生长，随着浓度的增加，对赤潮异弯藻生长的促进作用越来越强。在高浓度Cu(≥0.5 mg·L-1)的影响下，藻生长受到明显抑制，几乎所有赤潮异弯藻都无法正常生长；高浓度Pb(1～9 mg·L-1)对赤潮异弯藻有一定的抑制生长作用，但没有高浓度Cu明显。

2.2 Cu和Pb对赤潮异弯藻生长影响的参数分析

分析赤潮异弯藻的最大生长密度、生长周期以及比生长率可以基本了解赤潮异弯藻的生长情况、不同浓度Cu和Pb对藻细胞生长影响的差异，也可以用来比较不同浓度Cu、Pb的组间差异。

2.2.1 不同浓度Cu和低浓度Pb对赤潮异弯藻生长影响实验结果分析

表1为不同浓度的Cu(0～2.5 mg·L-1)和Pb(0～0.32 mg·L-1)作用下的赤潮异弯藻的最大生长密度、生长周期和比生长率的统计结果。藻细胞最大生长密度的最高值基本分布在Cu为0.02 mg·L-1时。在Cu为0.5～2.5 mg·L-1时，藻细胞密度显著减少，甚至为0，显示出不同浓度的Cu对赤潮异弯藻的最大生长密度影响较大。从生长周期来看，赤潮异弯藻生长周期最长能达到31 d，组间差异明显。最长的生长周期和最短的生长周期基本分布在Cu浓度为0.02 mg·L-1和2.5 mg·L-1的组别。比生长率的波动较大，这可能是由于2种重金属在不同浓度时对赤潮异弯藻的抑制和促进作用不同。

表2为不同浓度的Cu(0～2.5 mg·L-1)和Pb(0～0.32 mg·L-1)对赤潮异弯藻生长影响的各参数方差分析(F检验)结果。不同Cu浓度的藻最大生长密度、生长周期以及比生长率的差异显著(P<0.01)；而不同Pb浓度的藻最大生长密度有显著差异(P<0.05)，其余2个参数均无显著差异。不同浓度的Cu和Pb互作对赤潮异弯藻的最大生长密度有显著影响(P<0.01)，而对其生长周期和比生长率无显著影响。由此可见，在此浓度范围内，Cu对藻细胞生长的影响大于Pb的影响。

表1 不同浓度Cu和低浓度Pb对赤潮异弯藻生长影响的参数描述性统计Table 1 Descriptive statistics of different concentrations of Cu and low concentrations of Pb on Heterosigma akashiwo growth

注：M为平均数；SD为标准差。

Note: M is the mean; SD is standard deviation.

图5 不同浓度Cu和低浓度Pb对赤潮异弯藻生长影响的参数统计图Fig. 5 Statistical analysis of the effects of different concentrations of Cu and low concentrations of Pb on Heterosigma akashiwo growth

图5为不同浓度的Cu(0～2.5 mg·L-1)和Pb(0～0.32 mg·L-1)对赤潮异弯藻生长影响的参数统计图。最大生长密度的点在Cu浓度为0～0.1 mg·L-1时分布比较零散，Cu浓度相同的点分布不在同一条直线上，表明在这个范围内赤潮异弯藻生长受到Cu和Pb的影响较大。在Cu浓度为0.5～2.5 mg·L-1时，Pb对藻生长的影响被完全掩盖，而Cu对生长的影响明显。在生长周期图中，同浓度Cu的点基本分布在一条直线上，说明Pb对生长周期的影响较小。Cu浓度为0～0.1 mg·L-1范围的点分布较近且在上方，而Cu为0.5～2.5 mg·L-1时，散点分布在下方，说明Cu对藻细胞生长周期影响较大，且出现两极化，高浓度Cu(0.5～2.5 mg·L-1)明显缩短藻细胞生长周期。另外，不同浓度的Cu(0～2.5 mg·L-1)和Pb(0～0.32 mg·L-1)对赤潮异弯藻的比生长率影响效果与最大生长密度的影响效果相似。

2.2.2 不同浓度Cu和高浓度Pb对赤潮异弯藻生长影响实验结果分析

经汇总统计(表3)，不同浓度Cu(0～0.5 mg·L-1)和Pb(1～9 mg·L-1)作用下，藻细胞最大生长密度的最高值基本分布在Cu为0.1 mg·L-1时。在Cu为0.5 mg·L-1时，藻细胞密度显著减少。与低浓度Pb实验相比，该高浓度Pb的实验条件下的赤潮异弯藻最大生长密度整体偏低，表明高浓度Pb对赤潮异弯藻有一定的毒性。从生长周期来看，Cu浓度在0～0.25 mg·L-1范围内，赤潮异弯藻生长周期较均等，当Cu浓度达到为0.5 mg·L-1，藻生长周期明显缩短。

表4为不同浓度的Cu(0～0.5 mg·L-1)和Pb(1～9 mg·L-1)对赤潮异弯藻生长影响的各参数方差分析(F检验)结果。从表5可知，不同浓度的Cu和不同浓度的Pb，以及Cu和Pb的互作，对赤潮异弯藻的最大生长密度和生长周期存在显著差异(P<0.01)。不同浓度的Cu和Pb及其互作都对赤潮异弯藻的比生长率没有显著差异的影响。

不同浓度的Cu(0～0.5 mg·L-1)和Pb(1～9 mg·L-1)对赤潮异弯藻生长影响的参数统计图，如图6所示。最大生长密度的点分布比较零散，其中Cu浓度为0.5 mg·L-1时，散点分布趋于同一条直线上，表明赤潮异弯藻生长受到Cu和Pb的影响较大，但当Cu浓度为0.5 mg·L-1时，Pb对藻生长的影响被完全掩盖。在生长周期图中，Cu浓度为0～0.25 mg·L-1范围的点分布较近且在上方，而Cu为0.5 mg·L-1的散点分布在下方，说明Cu对藻细胞生长周期影响较大，且出现两极化，高浓度Cu(0.5 mg·L-1)有明显缩短藻细胞生长周期的作用。从比生长率来看，各个散点基本集中在一起，不同浓度的Cu(0～0.5 mg·L-1)和Pb(1～9 mg·L-1)对赤潮异弯藻的比生长率影响不大。

3 讨论(Discussion)

3.1 Cu和Pb对海洋浮游藻类生长和群落结构的影响

从结果可以看出，高浓度的Cu和Pb对赤潮异弯藻的生长具有抑制作用，这可能是高浓度的重金属离子对赤潮异弯藻细胞线粒体有损伤，影响光合作用的电子传递系统，阻碍蛋白质合成，从而抑制了藻细胞生长[14-15]。当Pb浓度在0～0.32 mg·L-1时，较低浓度的Cu(0～0.2 mg·L-1)对赤潮异弯藻的生长有一定的促进作用，较高浓度的Cu(0.5 mg·L-1、2.5 mg·L-1)对藻细胞有明显抑制，这与前人研究结果一致[12]。Cu浓度相同时，低浓度Pb(0～0.32 mg·L-1)对赤潮异弯藻的生长有促进作用，但当Cu浓度超过0.5 mg·L-1时，Cu对藻细胞的抑制作用掩盖了低浓度Pb的促进效果，显示出低促高抑的Hormesis效应[16]。Pb浓度在1～5 mg·L-1时对赤潮异弯藻有一定的毒性，当Pb浓度在7～9 mg·L-1范围内，随着Pb浓度的升高，对赤潮异弯藻生长的抑制作用越明显，这与张莹莹[13]的研究结果一致。当高浓度Pb(1～9 mg·L-1)和不同浓度Cu的共同作用下，Cu浓度在0～0.1 mg·L-1范围都存在促进赤潮异弯藻生长的作用，相比低浓度Pb条件下的Cu促进藻生长的浓度范围有所扩大，这可能是Cu和Pb之间存在拮抗作用。

表3 不同浓度Cu和高浓度Pb对赤潮异弯藻生长影响的参数描述性统计Table 3 Descriptive statistics of different concentrations of Cu and high concentrations of Pb on Heterosigma akashiwo growth

注：M为平均数；SD为标准差。

Note: M is the mean; SD is standard deviation.

表4 不同浓度Cu和高浓度Pb对赤潮异弯藻生长影响的参数方差分析结果(主体间效应的检验)Table 4 Variance analysis of different concentrations of Cu and high concentrations of Pb on Heterosigma akashiwo growth (test of inter-subject effects)

图6 不同浓度Cu和高浓度Pb对赤潮异弯藻生长影响的参数统计图Fig. 6 Statistical analysis of the effects of different concentrations of Cu and high concentrations of Pb on Heterosigma akashiwo growth

不同浓度的Cu和Pb对海洋不同的浮游藻类的影响不同，一般情况低浓度Cu(0.01～0.1 mg·L-1)对浮游藻类生长有促进作用，当Cu浓度达到0.25～0.5 mg·L-1时有明显的抑制藻生长效应[12]；Pb对赤潮异弯藻、旋链角毛藻、海洋原甲藻和裸甲藻等几种不同的浮游藻类的影响差异比较大，当Pb浓度达到10 mg·L-1时，对各藻类都存在明显的抑制作用[17]。

藻细胞可通过分泌胞外物质和利用胞内金属硫蛋白来降低重金属的毒性[18]，另有研究表明营养盐浓度的高低也会影响海洋浮游植物对重金属的耐受性，在f/2营养液的培养条件下，重金属对海洋单细胞藻类的半最大效应浓度(EC50)值明显高于自然海水条件下的值[17,19]，这可能是营养盐与重金属离子之间存在拮抗作用[20]。在本实验中采用的是f/2营养盐配方，营养盐浓度远高于真实海水，所以本实验结果可能低估了野外环境中Cu和Pb共同作用对赤潮异弯藻生长的影响，在自然条件下重金属对赤潮异弯藻可能会产生更大的毒性，而较低浓度的Cu和Pb能够促进藻细胞生长，条件适宜时可能爆发赤潮。

在野外环境中，重金属通过影响浮游藻类的正常生长，进一步影响浮游藻类的群落结构。有研究发现，高浓度Cu能够影响藻类群落结构及组成，并且在不同的季节浮游藻类对Cu离子的响应不同[21]，另外Cu浓度增加还可能会减少浮游植物的种类，影响藻类的多样性[22]。

3.2 海区重金属含量分布及潜在生态影响

我国近海海域重金属污染主要包括Cu、Cr、Zn、Cd、Pb和Hg等[23]，主要来源于化工、金属冶炼、电镀和轮船制造等行业。湛江湾位于粤西雷州半岛的东北侧，港湾东西两岸连接大陆，有南三岛、东海岛、硇洲岛等岛屿为天然屏障，是一个典型的口小腹大的港湾，港内海水较少与外海交换，海水流通性不强，许多陆源营养盐和污染物汇集在港内难以扩散。

随着湛江的发展，湛江湾的海洋环境承受的压力越来越大，宝钢基地和中科炼化项目的落实，以及其他工业、农业和生活污水的排放，导致湛江湾内重金属含量升高。2008年湛江湾内，表层和底层水体的Cu含量平均值分别为4.45×10-3mg·L-1和4.49×10-3mg·L-1；水体中的Pb总体含量较低，表、底层水体的平均含量为0.76×10-3mg·L-1和0.82×10-3mg·L-1[24]。另有研究显示，在不同季节湛江湾海域养殖区的Cu和Pb的含量不同。2010年，春季和夏季的各养殖区Cu含量范围分别为(3.5～6.2)×10-3mg·L-1和(25.7～33.3)×10-3mg·L-1；秋季含量在(16.5～21.9)×10-3mg·L-1之间，冬季则是ND～19.5×10-3mg·L-1(ND为未检测出)。除了春季，其他季节几乎都超出渔业水质标准规定的含量即10×10-3mg·L-1，养殖区内Cu含量普遍偏高。4个季节中，各养殖区Pb含量相差不大，且没超过渔业水质标准，属于一、二类海水水质[25]。刘芳文等[26]的调查结果略有不同，2013年湛江湾内夏季Pb含量为(3.00～5.50)×10-3mg·L-1，Cu含量为(3.40～7.60)×10-3mg·L-1；冬季Pb含量为(1.50～6.50)×10-3mg·L-1，Cu含量为(2.00～6.20)×10-3mg·L-1。参照《海水水质标准》[27]中重金属含量的标准值，湛江湾内水体中Cu含量符合国家二类海水水质标准(Cu≤10×10-3mg·L-1)，部分Pb含量超过了国家二类海水水质标准(Pb≤5.5×10-3mg·L-1)，但未达到国家三类海水水质标准(Pb≤10×10-3mg·L-1)。但在湛江湾的养殖区域内Cu的含量基本超过国家二类海水水质标准，Pb的含量基本符合国家二类海水水质标准。从湛江湾的底栖贝类重金属含量来看，Cu和Pb的含量随生物种类、检测部位等不同而不同，仅有少数种类略高于国家标准[25,28]。

与本论文实验结果对比，湛江湾内Cu和Pb的含量都是低浓度范围，可能存在促进浮游藻类生长的作用，特别是在养殖区域。由于人工添加营养盐，养殖区域内营养盐含量比一般的海水环境高。在夏秋冬季，湛江湾内养殖区域附近海域的Cu浓度达到0.02 mg·L-1左右，可能会促进赤潮异弯藻的快速生长。Mohamed等[29]调查发现高养分的养虾场径流，可能是赤潮异弯藻爆发赤潮的重要原因。湛江湾内Cu和Pb的含量较低，不会对海洋浮游藻类生长产生明显的抑制作用，但与本实验相比，湛江湾海水营养盐含量较低，重金属对藻类表现的毒性会更强。总的来说目前湛江湾水体重金属污染情况不是非常严重，但有加重的趋势。湛江湾水体流通弱，营养盐和重金属易蓄积，而且赤潮异弯藻曾在湛江湾出现，因此，具有一定的潜在风险。

致谢：本研究获得了广东海洋大学创新强校工程项目(GDOU2016050244)和国家自然科学青年基金(C31200303)的资助。