前列腺癌血清中lncRNA HOTAIR的表达及临床意义研究

刘 锐，张 鹏，程 龙，徐振宇，彭 辉

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 1.检验科；2.药学部；3.出入院管理科/重大疾病非编码RNA实验中心，安徽 芜湖 241001)

前列腺癌是一种常见的男性泌尿系统恶性肿瘤，占所有男性肿瘤总发病率的第二位和病死率的第六位[1]。在欧美国家的发病率高于亚洲国家,但是近年来,我国前列腺癌的发病率也在明显上升。前列腺癌发现时多数分期偏晚，肿瘤已经局部浸润或远处转移，且低分化肿瘤所占比例更高[2]。目前，前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)仍然为临床常用的前列腺癌初筛、辅助诊断和预后评估的分子标志物，尽管PSA在中晚期前列腺癌血清中明显升高，但对于早期前列腺癌的诊断，其灵敏度及特异度较低，已无法满足临床需求。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度>200 nt的ncRNAs分子，其本身不参与蛋白质的编码过程，而是以RNA的形式通过表观遗传、转录和转录后的调控参与基因表达的调控[3-4]。相关报道表明lncRNA 可能为一类新的潜在肿瘤分子标志物，如HOTAIR[5]、ncRuPAR[6]等。有研究发现，lncRNA-Hox基因的反义基因间RNA(Hox transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR)在前列腺癌组织中高表达，且与前列腺癌的临床病理组织分期、淋巴结是否转移及预后有关[7]。为了进一步研究HOTAIR在前列腺癌诊断及预后评估中的作用，本研究通过检测前列腺癌患者血清中HOTAIR的表达水平，分析其与临床病理组织分期之间的关系，并探讨其在前列腺癌临床诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例选自弋矶山医院2015年1月～2018年1月，经过组织病理学确诊的前列腺癌患者62例，年龄60～78岁，平均(72±5.3)岁；TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期19例，Ⅲ期24例，Ⅳ期9例；术前均未接受激素治疗、放化疗等抗肿瘤治疗。另选62例健康体检男性作为正常对照组。采集患者术前及对照组空腹静脉血5 mL，放置30 min后，1000 r/min离心15 min，吸取血清至无热原离心管中，12 000 r/min离心5 min，分离血清至新的无热原离心管中，-80℃保存。本研究通过医院伦理委员会审核批准且征得所有研究对象的知情同意。

1.2 主要试剂 实验中所用 Trizol LS购自美国Invitrogen公司;逆转录试剂盒Prime Script RT reagent kit和PCR扩增试剂SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂购自大连Ta Ka Ra公司;LncRNA HOTAIR及内参基因 GAPDH的引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 总RNA提取和cDNA合成 严格按照TRIzol LS试剂盒说明书提取所有血清中的总RNA，用722紫外分光光度计定量所提的RNA浓度及纯度，要求总RNA的吸光度A260/A280值在1.8～2.1内，用DEPC处理的无酶水溶解提取总RNA,-80℃保存。采用逆转录试剂盒Prime Script RT reagent kit进行cDNA第一链合成，具体如下：加入10 μL 60 mg/L RNA、3 μL 5×g DNA清洗缓冲液和1 μL g DNA 清洗液，混匀后于65℃反应5 min，冰上冷却,离心收集上清,依次加入5×Prime Script Enzyme Buffer 4 μL、Prime Script Enzyme 1 μL以及Prime Script RT Mix 1 μL和RNase free dH2O 4 μL，混匀，35℃10 min、95℃5 min，冰上冷却，获得cDNAs-20℃保存。

1.4 qRT-PCR 根据GenBank的HOTAIR全长基因序列，应用Premier 5.0设计HOTAIR特异性的引物。HOTAIR上游引物:5′-CTTGCATCACATCTGCCTATTCGCATCG-3′，HOTAIR下游引物:5′-ACACCATCACCAGACGACTCGTCAG-3′。 GAPDH上 游 引 物:5′-CCGTGTCATCAGCCTGAT-3′，GAPDH下 游 引 物:5′-GTCACGTAGCTCGTTAGGTA-3′，引物全部由上海生工生物有限公司合成。使用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒,以合成后的cDNA为模板，进行PCR扩增，总反应体系为20 μL，以GAPDH作为内参照。反应条件为：95℃反应30 s，95℃ 10 s、60℃ 30 s，35个循环。采用2-△△Ct法分析血清中HOTAIR的表达水平。

2 结果

2.1 前列腺癌患者血清中lncRNA HOTAIR的表达水平 采用实时定量PCR进行检测，结果发现前列腺癌血清中HOTAIR相对表达量为3.38±2.15，高于正常对照组(2.21±1.09)，差异有统计学意义(t=3.822,P<0.01)；由工作特征曲线分析发现，用于诊断前列腺癌，当血清HOTAIR的相对表达量>2.35时，灵敏度为69.4%，特异度为71.0%，曲线下面积为0.709 (图1) ,提示血清中HOTAIR的表达水平可能用于前列腺癌检测。

2.2 血清中lncRNA HOTAIR的表达水平与临床病理参数及PSA值的关系 为了明确HOTAIR的相对表达水平对于诊断前列腺癌的临床意义，我们分析了前列腺癌血清中HOTAIR表达水平与患者病理参数的关系，分析发现病理分期TNMⅠ和Ⅱ期前列腺癌血清中HOTAIR表达水平的差异无统计学意义(P=0.579)，而Ⅲ期前列腺癌患者血清中HOTAIR水平高于Ⅰ期和Ⅱ期前列腺癌患者(P分别为0.018和0.026)，且Ⅳ期前列腺癌患者血清中HOTAIR水平亦高于Ⅰ期、Ⅱ期(P<0.001)，也高于Ⅲ期患者(P=0.002)(表1)。同时，有淋巴结转移患者高于无转移的患者(P=0.006)。进一步分析比较血清中HOTAIR 的相对表达水平与PSA值(化学发光法，AXSYMI 2000)的相关性，发现两者呈正相关(r=0.48,P<0.001，图2) 。

图1 前列腺癌患者血清中HOTAIR的灵敏度和特异度相关性分析

图2 前列腺癌患者血清中PSA与HOTAIR表达值的相关性分析

表1 前列腺癌血清中HOTAIR水平与临床病理参数关系

临床病理参数nHOTAIRt/FPTNM 分期 Ⅰ102.06±0.8310.106<0.001 Ⅱ192.45±0.91 Ⅲ243.7±1.66ab Ⅳ9 5.98±3.56abc淋巴结转移 无382.8±1.362.8580.006 有244.32±2.8

注：a表示与Ⅰ期比较差异有统计学意义(P<0.05)，b表示与Ⅱ期比较差异有统计学意义(P<0.05)，c表示与Ⅲ期比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

前列腺癌的发生具有多基因、多因素参与的特点，而各种调控基因在肿瘤的发生、发展进程中起着重要的作用。有研究发现lncRNA的表达水平失调与肿瘤的发病、浸润、转移以及预后相关[8-10]。HOTAIR为第一个被证实的有反式转录调控作用的lncRNA，基因定位于HOXC (12q13．13;ref．2) 位点，充当“分支架”作用，基因全长2364 bp，其由1个长外显子和5个短外显子组成，主要通过5′结构域和3′结构域募集复杂蛋白复合体来调控靶基因的表达[11]。多项研究发现HOTAIR在乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌、淋巴瘤等肿瘤中高表达[12-14]。由于lnc RNA在不同肿瘤、不同组织部位中具有特异度好、稳定性高的特点，且lnc RNA在大多数心血管病和肿瘤患者的外周血循环中可以检出，表明其有可能成为某些疾病诊治、预后判断的标志物[15-16]。目前国内有关HOTAIR在前列腺癌发生、发展中的机制研究尚无报道。本研究采用实时定量PCR测量前列腺癌患者血清中HOTAIR的表达水平，结果显示前列腺癌血清中HOTAIR的表达水平高于对照组(P<0.01)，此结果与国外相关报道的研究结果一致[17]，提示HOTAIR在前列腺癌病理发展过程中发挥一定作用。本研究的临床意义在于通过分析前列腺癌患者血清中HOTAIR的表达水平，可以对前列腺癌诊断、治疗及预后评估提供帮助。研究还进一步明确了前列腺癌患者血清中HOTAIR水平与临床病理资料之间的关系，发现Ⅲ/Ⅳ期前列腺癌患者血清中HOTAIR水平高于Ⅰ/Ⅱ期，表明随着前列腺癌的恶性进展增高，HOTAIR水平越高，提示HOTAIR可能与前列腺癌的发生、TNM分期及肿瘤负荷有关，结果与国内外学者研究结果[18-19]一致。本研究还发现前列腺癌血清中HOTAIR表达水平与是否有淋巴结转移有关，在有淋巴结转移的前列腺癌血清中，HOTAIR表达水平高于无淋巴结转移者，结果提示HOTAIR可能参与了前列腺癌的侵袭转移过程；而且工作特征曲线分析表明HOTAIR的表达水平对前列腺癌的诊断有较高灵敏度和特异度，表明外周血循环中HOTAIR有望成为一种新的诊断前列腺癌的分子标志物。实验结果还发现前列腺癌血清中HOTAIR的表达水平与PSA值呈正相关，提示可以将血清中HOTAIR的表达值与PSA进行联合，进而提高对前列腺癌诊断的准确性。

综上所述，本研究发现前列腺癌患者血清中HOTAIR的表达水平高于正常对照组，而且与前列腺癌病理TNM分期及有无淋巴结转移和PSA值紧密相关，预示血清中HOTAIR的表达水平升高可能与前列腺癌的发生、发展过程密切相关。如果在后期的其他多中心、大规模样本研究中得到进一步验证，血清HOTAIR表达水平有望用于前列腺癌的早期诊断、病情监测和预后评估等。因此，进一步深入研究HOTAIR在前列腺癌的发生发展过程中的作用机制，对于前列腺癌的临床诊疗和预后评估具有重要意义。