中国传统食醋微生物污染及控制措施研究进展

王兴洁，刘爱平，敖晓琳,2，吴远明，陈蓉，刘书亮,2*

1(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625014)2(四川农业大学，食品加工与安全研究所，四川 雅安，625014) 3(四川保宁醋有限公司，四川 阆中，637400)

食醋是以淀粉和(或)糖经过酒精发酵、醋酸发酵而制成的含醋酸的液态酸味调味品[1]。食醋按照工艺可分为以下两类：以果实、糖类物质、酒精为原料的液态发酵食醋，及以谷物为原料的固态发酵食醋[2]。欧美国家食醋普遍采用液态深层发酵技术酿制而成，其中最具代表的是英国麦芽醋(Malt vinegar)、意大利古典芳香醋(Balsamico)、西班牙雪利醋(Sherry winegar)及奥地利苹果醋(Apple vinegar)[3]。中国及其他东南亚国家，主要采用多菌固态发酵工艺酿制食醋，其中中国四大名醋及日本米醋最受欢迎。固态发酵过程中除了醋酸菌之外，还有乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌和霉菌等微生物，它们在酿造过程中的共同作用赋予食醋丰富的滋味与气味[4-5]。多菌种固态发酵的食醋由于多种微生物的混合代谢作用，能够产生更丰富的有机酸、氨基酸和酯类物质，使得食醋的口感更加饱满柔和[6]。同时也使食醋具有抗菌、抗氧化、抗糖尿病、抗癌症肿瘤、预防肥胖、降胆固醇、抗高血压等多种功能性[7-9]。食醋作为我国传统酸性调味品，拥有3 000多年的发展历史，其生产离不开微生物的催化，随着食醋发酵产业的不断发展，从自然菌群到单一菌株再到多菌种的使用，微生物在食醋发酵的过程中占据着越来越重要的地位。但微生物同时也是影响食醋品质的极大威胁因素，有害微生物的污染和生长，不仅会影响产品质量还会对人们身体健康造成危害[10]。

本文综述了中国食醋行业污染微生物的原因及危害，并对其检测、控制措施进行了归纳总结，以期为食醋污染微生物的深入研究提供参考。

1 食醋污染微生物的原因及危害

1.1 食醋污染微生物的原因

中国传统食醋在生产过程中易受到微生物的污染。目前研究认为微生物污染食醋主要原因有以下几点：(1)传统食醋的酿造过程为开放式，环境中的污染微生物极易进入发酵体系，污染食醋[11]。(2)食醋生产过程中的容器与管道消毒灭菌不彻底，产品在储存与运输以及包装过程中管理不善，导致外来微生物污染。(3)食醋本身含有丰富的还原糖及氨基酸等营养物质，酒精发酵及醋酸发酵过程中的某些芽孢杆菌会产生耐热芽孢在后续杀菌中存活下来，在成品中生长繁殖，二次发酵导致产品污染[12]。

1.2 食醋污染微生物的危害

微生物污染食醋的危害是双方面的，厂家及消费者都受其害。首先，发酵过程中污染微生物进入发酵体系，与发酵微生物产生竞争关系，导致发酵不完全，发生糖化不彻底、酒精发酵、醋酸发酵弱等现象，降低出醋率[13]。其次，食醋成品出厂之前按照标准进行检测，未发现异常，却在货架期内发生变质现象，这对企业产生直接的经济损失，并且使企业的形象在消费者的心中一落千丈。最后，食醋在生产过程中会生成生物胺，少量的生物胺可提升食醋风味品质，但是过量生物胺则对人体有极大的危害。污染微生物在酸性环境下产生应激反应，分泌出氨基酸脱羧酶，氨基酸转换为生物胺可使pH升高，有利于微生物在酸性环境中的生存[14-15]。微生物对食醋的污染导致食醋中生物胺等有害代谢物的含量增高，对消费者的健康产生潜在危害。

中国食醋开放式的发酵工艺是食醋被微生物污染的根本原因，变质食醋的危害可大可小，一旦控制不当，在某个企业或者整个行业发生，将对食醋行业造成一定的影响和经济损失。

2 食醋中污染微生物种类及现象

微生物污染食醋后，成品出现的可观察到的现象包括胀气、产膜、发黏、沉淀增多返浑等，这些现象可单独出现，也会并存出现。引起食醋变质的微生物多种多样，不可一概而论，在进行食醋污染微生物的研究时，应当具有针对性地探索。作为人们生活不可或缺的传统调味品，其污染微生物的研究还十分肤浅，有待深入。

2.1 食醋产气污染菌

食醋胀气问题由来已久，分为生物性胀气和非生物性胀气，其中微生物污染导致胀气最为严重。马净丽等[16]认为食醋胀气变质是令食醋(尤其是固态食醋)生产厂家非常头疼的问题。在北方，每年3～4月份，食醋胀桶开始发生，并在6、7、8三个月呈泛滥之势。虽然传统食醋胀气现象时有发生，但并未引起整个行业的注意。2015年6月某地的山西老陈醋发生明显胀气现象，无独有偶，某晒醋公司的食醋也在同一年出现严重的胀气现象[17-18]。众多食醋企业相继爆发出大规模的产品产气现象，整个行业蒙受了巨大的经济损失，同时关于食醋产气污染菌的研究也逐渐深入。ENTANI等[19]1986年首次从日本变质的谷物醋中分离鉴定出高耐酸乳酸菌，该菌生长缓慢，能引起谷物醋浑浊变质。表1列举了部分国内外分离得到的食醋产气污染微生物[20-22]。但马净丽等[16]未从胀气食醋中分离得到产气菌，刘芳[23]采用传统培养与高通量测序相结合的方法对食醋产气污染菌进行研究，高通量测序结果表明，引起食醋胀气变质的微生物为乳杆菌属，但通过固体培养基分离纯化未能得到菌落，推测此产气微生物存在活的不可培养状态或不可培养导致难以分离的状态。LI等[17]，白成松等[18]研究表明食醋胀气菌难以分离，菌株受到食醋影响会发生特化，普通培养基可能无法分离，因此微生物分离方法需要改进。

表1 食醋产气污染菌Table 1 Microorganism that cause vinegar to produce gas

2.2 食醋产膜污染菌

食醋在发酵过程中会产生一层菌膜，菌膜的存在对醋酸发酵是利是害还没有一个确切的定论[24]。有观点认为，发酵过程中菌膜的形成不利于醋酸发酵，大量的研究报道表明，醋酸菌产生的菌膜组成成分主要为胞外多糖，形成这些物质时菌体会消耗环境中的营养物质，特别是碳源和氮源[25]，减少食醋的产量和降低发酵液的醋酸酸度，因此食醋酿造过程中应严格控制菌膜的形成。对于成品醋而言，产膜则直接影响消费者的选择，给企业带来不小的损失。赵爽等[26]从袋装产膜醋中分离出8株产膜菌，对其中两株进行鉴定，一株为木葡糖醋酸杆菌(Gluconacetobacteroboediens)，另一株为巴氏醋杆菌(AcetobacterPasteurianus)。张永凤[27]分离得到一株醋化醋杆菌木质亚种(A.xylinum)Y22，所产菌膜主要成分是细菌纤维素。另外，产膜食醋中还分离出了枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)[28]。

2.3 食醋发黏及返浑污染菌

食醋被微生物污染后出现发黏劣变，伴随着醋液变黄，醋体流动性变差，有拉丝现象，后期还会产生大量沉淀发生返浑现象。CAO等[29]对发黏食醋理化指标和香气成分进行分析，发现食醋中总酸、乳酸、乙醇含量明显上升，还原糖、总酯、糠醛含量明显下降，并从中筛选出引起食醋发黏的主要微生物牛痘乳杆菌(Lactobacillusvaccinostercus)。王建云等[30]探讨食醋发黏控制技术，筛选得到导致食醋发黏的微生物为芽孢杆菌(Bacillus)。杨新等[31]从变质赤水晒醋中筛出增黏微生物4株，均为芽孢杆菌(Bacillus)。另有研究表明，鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)在醋液中会产生白色絮状物，导致食醋黏稠[12]。

食醋的生物性返浑是食醋受到微生物污染后沉淀增多液体混浊的一类现象，其进程较快，对感官、品质有较大影响。目前报道的造成食醋返浑的微生物有芽孢杆菌属(Bacillus)和葡糖杆菌属(Gluconobacter)，其中芽孢杆菌更容易使食醋发生返浑现象，而芽孢杆菌大量存在于食醋发酵过程中，后期杀菌过程不易杀灭，研究表明100 ℃处理30 min后，菌株仍能生长[28, 32-33]。

3 检测方法

食醋污染微生物对中国传统食醋行业的发展有着巨大的阻碍，但目前对食醋污染微生物的研究并不系统，在其检测方面的研究也十分欠缺。在国内，食醋出厂前需按照《GB 2719—2018 食品安全国家标准食醋》进行检测，微生物指标易受到pH值的影响[34]，且食醋中可能存在难培养或不可培养的污染微生物[35]，采用传统检测方法易发生错检、漏检的情况。

3.1 食醋污染微生物的可培养技术检测方法

针对食醋污染微生物的检测研究，大多数是通过人工制作的培养基直接进行培养，这就要求培养基要为污染微生物提供所需的营养成分，得到培养物后再通过不同菌落、细胞形态，以及生理生化特征和分子鉴定来确定污染微生物的类型。虽然这是一种常见常用的检测方法，但此类检测方法有以下几方面的不足：(1)检测时间长。一般污染微生物检测至少需要2 d，多则7 d以上[17]，检测结果具有滞后性。(2)操作繁琐，灵活性差。不同的污染微生物最适生长培养基、培养温度、pH等的确定需要花费大量的人力物力[36]。(3)存在活的不可培养状态微生物或不可培养微生物。此类微生物难培养或不可培养，不能通过传统检测方法检测出来[37]。

3.2 食醋污染微生物的非培养技术检测方法

微生物非培养技术是指应用分子生物学技术对微生物进行检测鉴定。自1986年PACE等[38]首次将5S rRNA基因用于环境样品中总微生物的测定，随之很快被应用于微生物多样性研究。随着分子生物学技术的不断发展，其中聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术在检测方面极大地提高了检测效率，具有方便、快捷、省时省力等优点[39]。

啤酒作为与食醋类似的一类发酵食品，对其污染微生物的快速检测技术研究较多。目前对啤酒有害微生物的PCR检测技术有普通PCR、实时荧光定量PCR、PCR-酶联免疫吸附实验3种方法[40]。使用特异性引物的PCR技术可快速检测和鉴定啤酒中的腐败微生物，检测结果既灵敏准确又快速方便。而利用微生物非培养技术检测食醋污染微生物的研究较少，现有研究多集中在食醋发酵过程中微生物群落变化[41]。ZHAI等[20]通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)技术对污染醋样的微生物结构和种类进行分析，并与传统微生物培养方法结合，结果方便可靠。栾春光等[42]利用高通量测序技术鉴定陈醋胀壶微生物菌群，结果表明，在食醋样本中普遍存在某些已经适应了酿造食醋微环境的未培养微生物。

除纯培养法和PCR技术外，还有电阻抗法、微量量热法、流式细胞计数技术、酶联免疫法、ATP生物发光检测技术等快速检测方法[43-44]。目前传统的检测方法已经不能满足食醋行业的日益发展，而各类新的检测方法还在起步阶段，未能应用于实际之中。随着研究的不断深入，建立食醋污染微生物的快速检测方法，尤其是针对成品食醋中难培养或不可培养的有害微生物检测方法，并应用于食醋行业，具有十分重要的现实意义。

4 控制措施

4.1 防腐剂对食醋污染菌的控制

中国传统食醋因其高酸度不易变质的特点，食品防腐剂的使用并没有受到重视，特别是各大名醋的特级产品，均是以不添加防腐剂为噱头。引起食醋变质的微生物不同，防腐剂对其控制效果好坏也不等。赵爽等[26]的研究表明，3种防腐剂(尼泊金乙酯、苯甲酸钠、山梨酸钾)均对食醋产膜污染菌有抑制作用，可通过添加防腐剂来控制货架期内食醋产膜。李伟丽等[45]从腐败醋中筛选出84株不同微生物，以芽孢杆菌为主，苯甲酸钠对芽孢杆菌的最小抑菌浓度已经超出其在食品中允许的最大添加量，使用新型防腐剂Nisin，在安全范围内可抑制芽孢杆菌的增殖生长。杨荣杰等[46]探究了4种防腐剂对食醋中产膜芽孢杆菌的抑制效果，其中Nisin和ε-聚赖氨酸两种天然防腐剂抑菌效果最好，因此研究低成本高效的天然防腐剂刻不容缓。王玉美等[32]添加1 g/kg苯甲酸钠于含有105CFU/mL芽孢杆菌的醋液中，可以延长返浑时间7 d。虽然防腐剂可以抑制产膜及返浑污染微生物，但防腐剂对食醋胀气污染菌的抑制效果不佳，马净丽等[16]研究了新型防腐剂(尼泊金乙酯、Nisin)对胀气食醋的防腐作用，结果表明添加尼泊金乙酯、Nisin 可推迟胀瓶发生，但在货架期内还是会发生胀气变质。

4.2 加热对食醋污染菌的控制

中国传统食醋生产过程都要经过熬煮工序，在这个过程中一些不耐热污染微生物可以被杀灭[47]。但食醋在后期运输、储存过程中仍存在被外界微生物污染的风险，导致最终产品变质，包装前的加热处理十分必要。ZHAI等[20]对1株食醋污染菌进行加热处理，93 ℃处理30 s后菌株的存活率为0.67%，处理60 s后几乎没有活菌存在。马净丽等[16]研究发现导致食醋胀气的微生物是一种非常耐热的杆菌，将胀气食醋在90～100 ℃煮40 min，微生物仍能存活，提高灭菌温度则会影响食醋风味。超高温瞬时灭菌作为一类新兴技术，有望解决此类问题。王建云等[30]应用超高温瞬时灭菌技术对食醋进行灭菌处理，优化灭菌条件得出145 ℃，6 s处理可较好解决由微生物污染而引起的食醋发黏变质，且不影响食醋风味。

除上述控制措施外，对于食醋污染菌的控制还可采用紫外线消毒技术、膜过滤技术等处理后可一定程度减少菌量[48-49]。以上控制措施虽然可以抑制或减少食醋污染微生物的数量，但是治标不治本，控制食醋因微生物污染而发生变质的最关键措施是减少外来污染。中国传统食醋开放式发酵过程极易受到环境中微生物的污染，作为传统行业应在保持原有风味的同时，不断向洁净的现代化工厂设计靠近，保证生醋熬制、熟醋的运输储存、管罐路的清洁卫生、包材的消毒、包装车间净化符合要求，才能从根本上控制污染微生物引起的食醋变质。

5 结语

中国传统食醋在我国人们日常生活中占了十分重要的地位，产量在世界范围内逐年增长，但目前对食醋的研究多集中在食醋风味物质以及发酵过程微生物群落结构的变化等方面，对于食醋污染微生物的研究少见系统报道。综上所述，传统食醋极易受到发酵过程和环境微生物污染而发生变质，对企业及消费者产生影响。污染微生物种类繁多，情况不尽相同，现有的检测技术及控制措施存在一定的缺陷。传统检测方法耗时耗力且可能对新型胀气菌无效，新型检测方法应当围绕特异性、灵敏性、快速性展开研究。目前的控制措施各有利弊，在不破坏食醋风味的前提下，更加有效、安全的杀菌抑菌技术需要不断探索。另外，构建腐败变质食醋中难培养或不可培养微生物的基因组库以及食醋变质过程中微生物群落多态性，将会对防止食醋变质提供有价值的理论依据。