两种苹果(等外果)汁贮藏期间挥发性成分变化

吴昕烨，刘璇，毕金峰，曹风，张彪，李潇

(中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工综合性重点实验室，北京，100193)

苹果(Malusdomestica)是蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)植物的果实，果实汁多、脆嫩、酸甜适口。联合国粮食及农业组织统计数据显示，2016年中国苹果产量4 444万t，占世界苹果产量的49.75%[1]。国家标准GB/T 10651—2008《鲜苹果》[2]对鲜苹果各等级的质量要求和容许度进行了规范，通常称低于二等品质量要求的鲜苹果为等外果。苹果等外果约占苹果总产量的20%，可作为苹果加工及苹果副产物利用的重要来源。目前苹果除鲜食外主要用于浓缩苹果汁的生产，非浓缩还原苹果汁因其更高程度地保留了苹果营养而逐渐受到消费者青睐。

苹果汁具有独特的风味，其中挥发性成分的种类和含量是影响其质量和产品特征的重要因素，是评价苹果汁品质的重要指标。目前鉴定出的苹果汁挥发性成分已有300多种[3]。主要包括酯类、醇类、醛类[4]，另含有少量酮类、萜烯类、醚类、烃类、酚类、脂肪酸类物质。苹果汁的挥发性成分取决于原料品种、产地、原料质量、加工过程和贮藏条件。

国内外研究学者已经对苹果汁的挥发性成分进行了广泛而深入的研究，目前的研究主要集中在挥发性物质提取和分析方法[3]、苹果汁的挥发性组成分析[4]、香气活性物质以及加工过程中香气物质的变化等。孙爱东[5]对酶处理苹果汁贮藏期间挥发性成分的变化进行了初步探讨，结果表明，酶处理结合低温贮藏有助于香气成分保留率的提高。ZHAO等[6]对苹果汁低温贮藏期间香气成分变化进行了研究，结果表明，经高压二氧化碳处理后主要香气成分显著提高，处理对苹果汁的“苹果”风味有增强作用。YI等[7]研究了苹果浊汁和苹果猕猴桃混合汁贮藏期间香气变化，发现加入猕猴桃果浆的混合汁“果香”降解及“异味”的形成明显减少。而针对不同苹果品种贮藏期间挥发性物质变化的研究较少。

鉴于目前苹果等外果广泛用于苹果汁加工产业的现状，分别分析富士和秦冠两个品种(等外果)苹果汁在贮藏期间挥发性成分组成和含量变化情况，对控制苹果汁挥发性成分利用和品质控制等具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

丁酸乙酯，2-甲基丁酸乙酯，乙酸丁酯，己醛，丁酸丙酯，1-丁醇，(E)-2-己烯醛，丁酸丁酯，己酸乙酯，3-甲基丁酸丁酯，乙酸己酯，2-甲基-1-戊醇，己酸丙酯，壬醛，丁酸己酯，1-庚醇，异辛醇，癸醛，芳樟醇，1-辛醇，十一醛，己酸己酯，2-十三酮，乙酸苯乙酯，β-紫罗兰酮，壬酸，癸酸：梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；(Z)-2-庚烯醛，6-甲基-5-庚烯-2-酮，乙酸苄酯，3-甲基丁酸己酯，β-大马酮，香叶基丙酮：天津港保税区源鹏食品配料有限公司；3-甲基-1-丁醇，正己醇，乙酸戊酯，丙酸丁酯，γ-癸内酯：北京百灵威科技有限公司；NaCl(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

气质(gas chromatography-mass spectrometer, GC- MS)联用仪(GC-MS-QP2010 Plus)，日本Shimadzu公司；自动进样器(AOC-5000)，日本Shimadzu公司；固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)进样器、萃取头(PDMS/DVB，涂层厚度65 μm)，美国Supelco 公司；榨汁机(Philips 1871)，荷兰皇家Philips公司。

1.3 原料

参试苹果品种为富士和秦冠，来自宁夏回族自治区中卫市，样品符合国家标准GB/T 23616—2009《加工用苹果分级》[8]规定的三级加工用苹果。果实的成熟度通过BLANPIED等[9]的方法确定。选取淀粉-碘指数在7～8的果实(分数为1～8依次表示不成熟到成熟)，去除腐烂果。

1.4 苹果汁制备

每种苹果取20 kg果实，用去离子水将苹果表面泥土杂质清洗干净，用纱布擦干。将果实四分为锲形块，去核和果蒂，除去磕伤、碰伤、挤伤部分，损失率控制在12%～15%(损失率按照《加工用苹果分级》计算)。将切块后的苹果进行榨汁，添加抗坏血酸(添加量为0.2 g/kg)进行护色，迅速加热至90 ℃并维持30 s， 经4层纱布过滤后于30 MPa进行1次均质，热灌装后倒罐10 min[10]，流水冷却至室温。

将果汁置于25 ℃恒温培养箱中贮藏，贮藏时间分别为0、1、2、4、8和16周，至贮藏节点时将果汁摇匀后装入50 mL离心管中，液氮速冻后置于-40 ℃保存备用。

1.5 固相微萃取

挥发性成分的富集方法采用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)。取6 mL苹果汁，加入1.6 g NaCl，100 μL 2-甲基-1-戊醇内标(质量浓度0.824 mg/L，用甲醇溶解)，混匀后置于自动进样盘。萃取头于250 ℃进行老化2 h，样品瓶于50 ℃平衡20 min后进行顶空萃取，萃取时间为30 min。

1.6 GC-MS分析条件

色谱条件：气相色谱柱为DB-wax(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为高纯氦气，柱流量为1.01 mL/min，分流比为30∶1。

升温程序：程序升温，进样口温度为200 ℃，初始温度40 ℃保持3 min，以5 ℃/min的速度升温至120 ℃，再以10 ℃/min升温至200 ℃，在200 ℃保持5 min。

质谱条件：离子源温度230 ℃，电离方式EI，电离能量70 eV，扫描范围35～300 amu，解析时间3 min。

定性：未知化合物经Scan模式扫描后，计算机检索的同时与NIST数据库对比，选择匹配度大于85的化合物。筛选出的物质与标准品比对进行精确定性。

定量：37种标准品根据质谱图选取1个定量离子和2个定性离子，用色谱甲醇配制标样混合液，混标浓度根据前期预实验中样品含量多少而定，分别稀释不同倍数，内标2-甲基-1-戊醇质量浓度为0.824 mg/L。分别取100 μL不同稀释倍数的混标和100 μL的内标加入到6 mL水中。按上述质谱检测条件进行分析。根据所得结果计算每种标准物质得到1条标准曲线。37种标准品通过标准曲线定量(SIM模式)，重复测定3次，取平均值。

1.7 统计分析

数据采用Excel 2010和Simca-P 11.5进行分析。

2 结果与分析

2.1 两种苹果(等外果)汁挥发性物质分析鉴定结果

本文采用SPME-GC-MS法分析富士和秦冠(等外果)果汁的挥发性成分，与标准物质对比定性，37种标准品通过标准曲线定量(SIM模式)，定量信息如保留时间、挥发性物质、定量与定性离子和线性范围等见表1，其中种类最多的是酯类(17种)、其次依次是醇类7种、醛类6种、酮类5种和酸类2种。

两种苹果汁中主要的挥发性成分包括酯类、醇类、醛类及酮类化合物，其中酯类和醛类化合物来自于β-氧化酶或脂肪氧化酶催化脂肪酸代谢，是构成苹果汁总体风味的主要物质[11]。贮藏过程中各类香气物质的种类及其含量见表2和表3。

由表2和表3可知，不同品种苹果汁的挥发性物质含量不同。结果表明，富士果汁挥发性物质含量远高于秦冠果汁，前者香气物质总量为后者的1.73倍，达到质量浓度4 386.52 μg/L。富士果汁中最主要的挥发性物质的是酯类化合物，质量浓度为2 122.50 μg/L，占总香气物质的48.38%，其次是醇类39.61%(1 737.92 μg/L)，醛类10.58%(464.23 μg/L)。

表1 GC-MS法定量信息表Table 1 Quantification information of GC-MS method

表2 贮藏过程中富士苹果(等外果)汁挥发性物质的变化Table 2 The variations of volatile compounds in substandard (Fuji) apple juice during storage

续表2

香气物质挥发性物质质量浓度/(μg·L-1)0周1周2周4周8周16周乙酸苄酯6.86±0.56b6.98±1.09b3.78±0.83a3.17±0.12a3.42±0.36a3.59±0.11a乙酸苯乙酯0.32±0.02a0.29±0.01a0.30±0.00a0.31±0.00a0.34±0.07a0.37±0.01aγ-癸内酯3.69±0.44a3.35±0.16a3.54±0.54a3.46±0.12a3.82±0.27a4.06±0.13a酯类2 122.50±118.992 644.37±109.002 384.33±132.502 115.83±72.672 236.95±53.202 065.93±136.441-丁醇300.46±34.04a303.23±21.50a305.53±30.13a273.15±22.40a284.01±9.74a299.61±8.45a3-甲基-1-丁醇660.46±56.06b387.77±20.37ab413.53±19.09ab315.63±10.37a169.38±5.23a168.97±12.42a正己醇758.95±31.89a766.02±10.34a733.96±42.30a700.42±41.20a710.00±31.73a728.60±14.27a1-庚醇0.93±0.14a0.83±0.14a0.86±0.10a0.82±0.00a0.86±0.06a0.87±0.04a异辛醇11.09±1.06b6.45±0.16a11.15±1.44b10.08±0.01b4.30±0.21a4.81±0.27a芳樟醇0.56±0.04abc0.49±0.00a0.56±0.05ab0.68±0.00bc0.67±0.08bc0.71±0.03c1-辛醇5.47±0.36a5.64±0.18a5.70±0.46a5.50±0.18a5.66±0.58a5.75±0.30a醇类1 737.92±123.591 470.43±52.691 471.29±93.571 306.28±74.161 174.88±47.631 209.32±35.78己醛215.90±13.42a307.08±30.01b261.16±16.06b238.36±18.17ab225.56±11.31a209.33±21.31a(E)-2-己烯醛224.05±10.21a234.08±18.61a249.46±14.93a231.27±11.2a214.98±28.71a266.87±21.17a(Z)-2-庚烯醛10.50±1.70b6.21±0.27a11.48±0.65b2.30±0.00c7.80±0.45ab9.68±1.55ab壬醛1.30±0.91a1.05±0.27a0.87±0.01a0.53±0.00b0.58±0.03b0.86±0.15a癸醛9.95±0.96a5.79±0.43b10.01±1.29a9.05±0.00a3.86±0.19b4.32±0.24b十一醛2.54±0.31a2.30±0.15a2.44±0.19a2.54±0.11a2.60±0.34a2.86±0.11a醛类464.23±27.51556.52±49.74535.43±33.13484.04±29.48455.40±41.03493.92±44.536-甲基-5-庚烯-2-酮8.68±0.76a6.71±0.37b6.88±0.42b7.80±0.21ab8.40±0.86a9.29±0.47a2-十三酮0.13±0.02a0.14±0.02a0.12±0.01a0.09±0.00a0.08±0.01a0.09±0.00aβ-大马酮15.80±4.11a19.83±0.14b19.97±1.84b18.86±1.72b19.73±2.95b18.23±1.03b香叶基丙酮28.77±1.84a37.82±0.11b37.90±0.89b34.19±2.78c35.69±1.32bc33.02±0.42cβ-紫罗兰酮0.20±0.08bc0.13±0.00ab0.10±0.01a0.23±0.00c0.14±0.01abc0.14±0.01abc酮类53.59±6.8164.64±0.6464.97±3.1761.16±4.7164.04±5.1560.78±1.93壬酸1.00±0.40a1.18±1.06a2.07±0.02b3.23±0.00b0.54±0.17c0.65±0.03c癸酸1.72±0.02a1.88±0.25a1.89±0.24a1.57±0.14a1.71±0.33a1.81±0.05a酸类2.71±0.423.06±1.313.96±0.264.80±0.142.26±0.502.47±0.08总量4 386.52±277.324 747.60±213.384 465.67±262.633 977.92±181.163 937.71±147.513 837.07±218.76

注：同行数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

表3 贮藏过程中秦冠苹果(等外果)汁挥发性物质的变化Table 3 The variations of volatile compounds in substandard (Qinguan) apple juice during storage

续表3

香气物质挥发性物质质量浓度/(μg·L-1)0周1周2周4周8周16周芳樟醇0.57±0.06a0.59±0.06a0.64±0.06a0.63±0.06a0.72±0.08a0.73±0.09a1-辛醇3.62±0.29a3.18±0.24a3.26±0.30a3.12±0.27a3.64±0.40a3.77±0.02a醇类1 522.45±90.641 396.83±73.431 432.56±54.121 010.08±44.511 242.83±44.011 097.92±13.69己醛274.34±21.84a234.74±11.28a207.74±1.57a250.45±26.37a255.24±2.21a189.28±5.61b(E)-2-己烯醛223.93±16.08b112.24±3.81a118.16±1.08a342.52±14.81 d481.51±11.24c448.44±11.43c(Z)-2-庚烯醛10.69±0.81c15.55±2.74 d15.84±0.83 d9.41±4.84bc8.53±2.29b6.71±0.72a壬醛1.89±0.03b1.75±0.29b1.41±0.06ab1.02±0.28ab0.80±0.09a1.11±0.10ab癸醛10.41±0.67c13.93±0.95 d19.14±0.81e6.44±0.37b2.71±0.23a1.52±0.08a十一醛1.19±0.09a1.31±0.06a1.34±0.16a1.22±0.14a1.41±0.19a1.51±0.07a醛类522.47±39.52379.51±19.13363.63±4.51611.05±46.81750.19±16.25648.57±18.016-甲基-5-庚烯-2-酮5.38±0.45a5.72±0.57a6.59±0.31a4.24±0.28b5.60±0.45a5.93±0.15a2-十三酮0.12±0.01b0.11±0.01b0.10±0.01b0.09±0.03ab0.05±0.00a0.08±0.01abβ-大马酮19.46±1.84a20.34±1.13a18.18±1.60a22.51±2.13a20.08±1.56a22.31±0.34a香叶基丙酮35.69±0.82a36.96±0.40a32.53±0.70a39.70±0.92a33.64±0.94a39.35±0.13aβ-紫罗兰酮0.35±0.03b0.14±0.02a0.17±0.00a0.24±0.00ab0.24±0.01ab0.21±0.02a酮类60.99±3.1563.27±2.1357.57±2.6266.78±3.3659.62±5.9667.89±0.65壬酸3.48±1.84ab4.03±0.59b4.89±0.13bc2.83±0.55a4.73±0.89b5.16±0.64c癸酸2.16±0.28b2.31±0.32b2.33±0.32b1.64±0.28a2.07±0.17ab2.26±0.09b酸类5.63±2.126.34±0.917.22±0.454.47±0.836.80±1.067.42±0.73总量2 529.23±160.182 174.56±126.302 177.19±81.482 018.78±113.122 429.50±82.132 222.38±45.39

注：同行数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

秦冠果汁总挥发性物质含量(质量浓度)低于富士果汁，各类物质比例也有所不同，其中醇类占60.19%(1 522.45 μg/L)，其余依次是醛类占20.65%(522.47 μg/L)、酯类占16.29%(412.09 μg/L)以及少量酮类、酸类物质。富士和秦冠果汁中，主要的挥发性成分基本相同，主要包括：丁酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸己酯、1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、正己醇、己醛和(E)-2-己烯醛，但富士中代表“果香”“甜香”的2-甲基丁酸乙酯的含量约为秦冠的15倍。

2.2 贮藏期间主要挥发性成分含量的比较

由图1可以看出苹果汁中总挥发性物质在贮藏期间的变化趋势，从贮藏开始至贮藏16周，富士和秦冠果汁的总挥发性物质含量均显著降低。

图1 贮藏过程中不同品种苹果(等外果)汁总挥发性物质的变化Fig.1 The variations of volatile compounds in substandard apple juice of two cultivars during storage

富士果汁在贮藏1周时，总挥发性物质含量增加，之后呈现下降的趋势，随着贮藏时间延长，下降趋势减缓，至贮藏16周时，总挥发性物质含量降低为贮藏起始的87.48%。秦冠果汁从贮藏起始至4周时，总挥发性物质呈现下降的趋势，至贮藏8周时，呈现显著上升的趋势，至贮藏16周时，总挥发性物质含量降低为贮藏起始的87.86%。贮藏结束时的两种果汁中挥发性成分保留率均大于87%，而孙爱东[5]的结果表明，在贮藏90 d时，香气成分保留率在73%以上，此差异原因可能是苹果品种和榨汁工艺的不同。

富士和秦冠果汁的主要挥发性成分含量在贮藏期间发生的不同程度变化，具体分析如下。

2.2.1 酯类香气物质

酯类化合物风味特征是甜香味和果香味[11]。酯类化合物的总量被用来评价苹果汁香气品质[12]。乙酸酯类是苹果汁主要的香气成分，其中高浓度的乙酸丁酯和乙酸己酯是多种苹果汁的特征成分[13]。NIKFARDJAM等[11]的研究表明，苹果汁中酯类化合物的质量浓度达到840 μg/L，本研究中富士和秦冠果汁中酯类化合物质量浓度分别达到2 122.50 μg/L和412.09 μg/L。两种苹果汁中主要的酯类物质均为丁酸乙酯(令人愉悦的苹果香[14]，甜香[14]，果香[15])、2-甲基丁酸乙酯(果味，青苹果味，甜香味[14])、乙酸丁酯(果味，苹果味[14])、乙酸戊酯(葡萄味[3])、乙酸己酯(甜香味，果味[14])。上述这几种酯类物质在富士果汁中的含量明显高于秦冠果汁，这也解释了富士果汁比秦冠果汁香气浓郁，果香味更浓郁。

富士和秦冠苹果汁中酯类物质的总量差异显著，贮藏期间变化规律也存在差异。贮藏期间两种果汁的酯类物质总量均呈现略微下降。富士果汁的酯类物质在贮藏1周后明显升高，而秦冠果汁中酯类物质明显下降。对单一酯类化合物而言，贮藏期间多数酯类物质含量呈现略微下降。

根据前期研究发现，富士苹果酯类质量浓度较高，为“酯香型”品种[16]。本研究中，富士果汁中丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸己酯、丁酸己酯(苹果味[15])和乙酸戊酯的质量浓度均高于秦冠果汁。富士果汁中丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和丁酸己酯的含量为秦冠果汁中的22.22倍、15.70倍和24.16倍。在贮藏结束时，多数单一酯类组分与贮藏起始时相比，未发生显著性变化或变化幅度较小。然而丁酸己酯质量浓度经过贮藏在富士果汁中显著降低(45.68～2.73 μg/L)，可能因为在酶或酸催化下发生了水解反应[6]。

图2 贮藏过程中不同品种苹果(等外果)汁酯类化合物的变化Fig.2 The variations of ester compounds in substandard apple juice of two cultivars during storage

2.2.2 醇类香气物质

苹果汁中的酯类、醛类和醇类物质赋予了苹果汁的特征香味，其中酯类和醛类的阈值低，尽管含量较低，但是构成了苹果汁主要的香气强度，醇类物质阈值较高，因其相对含量较高，也是苹果汁中重要的香气物质[17]。本研究发现，苹果汁中醇类物质含量较高，其中最主要的醇类物质是1-丁醇(清淡果香，甜香味[15])、3-甲基-1-丁醇(苹果香和辛辣味)和正己醇(清淡苹果味)，这与GAN等[13]的研究结果一致。

富士和秦冠果汁中醇类物质总含量差异不明显，随着贮藏时间延长，醇类物质总量呈现明显的下降趋势。3-甲基-1-丁醇来自于亮氨酸和异亮氨酸的转氨基和脱羧基作用[12]，3-甲基-1-丁醇是苹果汁香气的重要指标，其质量浓度越低，苹果汁香气品质越好。本研究中，富士和秦冠果汁3-甲基-1-丁醇的质量浓度分别为660.46 μg/L 和861.21 μg/L，至贮藏时间为16周时，3-甲基-1-丁醇分别降低为168.97 μg/L和477.07 μg/L。 1-丁醇具有果香和甜香味，己醇具有清香、苹果香及甜香味，对苹果汁总体风味均有积极作用[12]。其中正己醇是亚油酸的酶促反应的产物。两者在富士苹果汁中含量高于秦冠苹果汁，贮藏期间均未呈现显著变化。

图3 贮藏过程中不同品种苹果(等外果)汁醇类化合物的变化Fig.3 The variations of alcohol compounds in substandard apple juice of two cultivars during storage

2.2.3 醛类香气物质

苹果汁中含有较高的六碳醛类物质，这类物质源于果实破碎后脂肪氧化酶催化亚油酸和亚麻酸发生的氧化反应[15]。醛类物质在富士和秦冠果汁中含量分别为464.23 μg/L和522.47 μg/L，贮藏过程中，醛类香气物质总量呈升高趋势。

己醛(青草味)和(E)-2-己烯醛(绿苹果味)是苹果汁青草味的主要贡献物质[18]。富士和秦冠果汁中己醛(青草味)含量分别为215.90 μg/L和274.34 μg/L，(E)-2-己烯醛含量分别为224.05 μg/L和223.93 μg/L。贮藏过程中2种果汁的主要醛类物质变化规律类似，至贮藏结束，己醛含量下降，(E)-2-己烯醛含量上升，此变化趋势与张丽娜等的研究基本一致[19]。其中(E)-2-己烯醛含量增加可能因为脂氧合酶被重新激活，生成新的(E)-2-己烯醛[6]。在秦冠果汁中(E)-2-己烯醛含量升高至贮藏起始时的2倍，可能因为秦冠苹果中脂氧合酶活性高于富士苹果(图4)。

图4 贮藏过程中不同品种苹果(等外果)汁醛类物质的变化Fig.4 The variations of aldehyde compounds in substandard apple juice of two cultivars during storage

2.2.4 其他香气物质的变化

除酯类、醇类和醛类物质外，两种苹果汁中均鉴定出少量酮类和酸类物质。由图5可知，酮类化合物的含量高于酸类化合物，在贮藏期间，这两种香气物质变化趋势不明显。

酮类化合物主要包括6-甲基-5-庚烯-2-酮、β-大马酮和香叶基丙酮。6-甲基-5-庚烯-2-酮具有蘑菇味[20]，主要来源于萜类和脂类的氧化反应[21]。富士和秦冠果汁中6-甲基-5-庚烯-2-酮的质量浓度分别为8.68 μg/L和5.38 μg/L。

图5 贮藏过程中不同品种苹果(等外果)汁酮类和酸类物质的变化Fig.5 The variations of ketone and acid compounds in substandard apple juice of two cultivars during storage

3 结论

该研究结果说明富士和秦冠(等外果)果汁的挥发性成分组成含量差异较大，主要香气成分包括：丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸己酯、丁酸己酯、乙酸戊酯、1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、正己醇、己醛、(E)-2-己烯醛、β-大马酮和香叶基丙酮。两种品种果汁贮藏期间总挥发性成分的含量呈下降趋势，贮藏期间挥发性物质变化规律存在一定差异，酯类、醇类和酮类香气成分质量浓度呈下降趋势，醛类香气成分质量浓度上升趋势明显。此结果可为苹果(等外果)汁的品质控制提供科学依据。