右美托咪定诱导家兔心动过缓窦房结缝隙连接基因蛋白Cx45和Cx31．9表达研究

田友芳，吴 江，宋 伟，胡 兵，姚猛飞△

（1．福建省漳州正兴医院第二手术室，福建 漳州 363000；2．中国人民解放军第一七五医院麻醉科，福建 漳州 363000）

心动过缓又称心率过缓，是心律失常的一种类型。成人的正常心率是60～100次／分，而心率过缓是指心率低于60次／分，当低于45次／分时，常见临床表现有头晕、倦怠、乏力和精神不好等。目前，治疗心动过缓如纠正可逆转的原发病因及药品不良反应影响后，仍不可逆时，需植入心脏起搏器。右美托咪定是一种α2肾上腺素受体激动剂，具有中枢性抗交感作用，产生良好的镇静作用，临床常用于全身麻醉的手术患者气管插管和机械通气时的镇静；另外，对呼吸无抑制，能保护患者心、肾、脑等器官功能，具有镇痛、抗焦虑作用[1]。本研究中用右美托咪定注射3组健康家兔，通过实验检测窦房结缝隙连接基因蛋白Cx45和Cx31．9表达变化情况。现报道如下。

1 材料与方法

1．1 仪器

仪器型号和厂家详见表1。

表1 仪器型号和厂家

1．2 动物与分组

8周龄健康家兔，36只，雌雄各半，体质量2～3 kg，购于漳州正兴医院动物实验中心，在动物中心无菌条件下饲养，本实验由漳州正兴医院动物伦理委员会审核并通过。随机分为3组，各12只。对照组（A组）持续注射生理盐水15 mL／kg，作为空白对照；B组注射盐酸右美托咪定注射液（江苏恩华药业股份有限公司，国药准字H20090248，规格为每支2 mL∶200μg）20μg／kg负荷量10 min，10μg／（kg·h）持续注射50 min；C组注射右美托咪定80μg／kg负荷量10 min，40μg／（kg·h）持续注射50 min。

1．3 方法

采用司可巴比妥钠（北京益民药业有限公司，国药准字H11020900，规格为每支50 g）30 mg／kg麻醉家兔后仰卧固定，四肢插入针灸电极监测心电活动，排除心电图（ECG）异常家兔，采用生物信号采集处理系统分别于右美托咪定注射前（T0），注射后15 min（T1）、30 min（T2）、60 min（T3）监测心率（HR）和平均动脉压（MAP）。当B组和C组家兔的检测指标与A组出现显著差异，即与正常心率相比，B组和C组心率下降30%视为建模成功，继续进行后续实验。实验观察结束后加深麻醉，迅速开胸，取出心脏置于有台氏液（现配现用）的托盘内，分离窦房结组织。每组6只提取总RNA和总蛋白，进行蛋白免疫印迹杂交（WB）、实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测Cx45和Cx31．9的mRNA表达水平；6只用甲醛固定，石蜡包埋，切片，进行免疫组化（IHC）染色，每只切片取3个视野，计算平均光密度，即为Cx45和Cx31．9蛋白表达水平。其中，RT-PCR的引物序列见表2。

表2 目的基因扩增引物序列

1．4 统计学处理

采用SPSS22．0统计学软件分析。计量资料用X±s表示，行t检验；不同时点组内比较采用重复测量的方差分析，同时点组间比较行单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 给药过程中HR和MAP比较

T0时，3组组间HR和MAP比较，差异无统计学意义（P＞0．05），T1～T3时，B组、C组的HR和MAP显著低于A组（P＜0．05）；C组的HR明显慢于B组（P＜0．05）；B组、C组的MAP差异无统计学意义（P＞0．05）。详见表3。

表3 3组家兔给药过程中HR和MAP比较（X±s，n=12）

2．2 RT-PCR验证3组家兔窦房结组织Cx45和Cx31．9基因表达水平

Cx45 mRNA表达，A组＜B组＜C组，3组两两比较，差异有统计学意义（P＜0．05）；Cx31．9 mRNA表达水平，B组高于A组（P＜0．05），C组与B组差异无统计学意义（P＞0．05）。详见图1。

图1 3组家兔窦房结组织Cx45及Cx31．9 mRNA表达水平

2．3 IHC和WB验证3组家兔窦房结组织Cx45和Cx31．9蛋白表达水平

Cx45蛋白表达，A组＜B组＜C组，3组两两比较差异有统计学意义（P＜0．05）；Cx31．9蛋白表达水平，B组高于A组（P＜0．05），C组与B组无明显差异（P＞0．05）；IHC和WB结果一致。详见表4和图2。

表4 3组家兔窦房结组织Cx45和Cx31．9蛋白表达水平比较（X±s，n=6）

图2 WB验证3组家兔Cx45和Cx31．9蛋白表达水平

3 讨论

右美托咪定是一种无色透明液体，唯一同时具有镇痛和镇静作用的麻醉药物，能与中枢神经系统和周围神经系统，血管、肾脏等器官中广泛存在的α2肾上腺素能受体结合，使用者进入非自然睡眠，产生催眠、抗焦虑作用[2-3]。右美托咪定能减轻使用者短暂性整体或局部脑缺血后的神经损伤，具有保护神经的作用[4]。家兔心动过缓模型建造成功的基本要求是家兔正常心率下降30%，而右美托咪定能有效抑制窦房结和房室结的相关功能，临床麻醉和重症监护室中手术操作前或手术中镇静得到广泛使用[5-7]。同时，临床上使用右美托咪定后存在不良反应，如诱发心动过缓，会导致心脏负性频率和负性传导，存在使心脏停搏的潜在危险[8-9]。

本研究结果表明，家兔注射右美托咪定后导致心动过缓，从而使心脏组织中的Cx45和Cx31．9基因表达发生变化，间接表明Cx45和Cx31．9表达发生变化是导致家兔心动过缓的原因之一。由此可见，以Cx45和Cx31．9基因表达为作用靶点，干扰其表达，能缓解甚至治疗窦性心动过缓。但目前的研究结果表明，Cx45和Cx31．9基因表达与家兔窦性心动过缓有关，但其作用途径与具体作用机制并不清楚。右美托咪定以何为靶点，通过何种途径使Cx45和Cx31．9基因表达发生变化也需要进一步研究。由于Cx45和Cx31．9是2种低导电性的缝隙连接蛋白，在体内的传导方式相对较慢，从而使得新西兰白兔窦性心动过缓。

综上所述，基因Cx45和Cx31．9在给药前后，即家兔心动过缓前后发生差异表达。右美托咪定具有直接兴奋迷走神经的作用，影响自主神经的功能状态，而基因表达能直接影响窦房结缝隙连接蛋白的表达水平[10]。探讨基因Cx45和Cx31．9差异表达在家兔心动过缓中的作用，以及调控的分子机制，阐明其调控的分子信号通路，可为后期临床上利用分子靶向治疗心动过缓奠定基础，探寻新思路。