3个藏药经典方剂治疗脑缺血有效物质研究*

赵 骞，吴 莹，谭 锐

（西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031）

脑缺血致死、致残的重要原因是脑缺血造成的血管损伤和缺氧。藏药在治疗脑缺血方面的作用近年来逐渐被重视和发掘。谢彬等[1]报道，藏药二十五味珍珠丸、如意珍宝丸、十五味沉香丸（简称“3个藏药”）可显著降低脑缺血模型大鼠脑梗死面积，对脑部组织产生保护作用。但藏药药味较多，组方复杂，“3个藏药”共含有60余种药材，其中主要含有化合物种类包括三萜酸类、酚酸类、黄酮类、生物碱类，还含有挥发油、氨基酸及矿物质[2-4]。每味药材都是1个小复方，如何从众多主要成分中寻找针对不同药效的有效成分，成了一个需要解决的问题。血管内皮生长因子（VEGF）是一种特异性的促有丝分裂原，又称为促血管生成素、血管渗透因子，是影响血管发育的关键因子[5]，作为血管生成的调控者和血管渗透剂，与缺血后脑部循环系统的重建有关[6]。本研究中首先用含有VEGF启动子的质粒转染HEK-293细胞，构建了可用来筛选药物对这VEGF基因作用效果的细胞模型，并验证其有效性；然后用该细胞模型检测“3个藏药”中的17种主要成分，寻找哪些化合物可有效提高VEGF的转录水平，探讨了“3个藏药”治疗脑缺血的物质基础，从经典验方入手，为藏药有效成分、药理作用的研究了提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1．1 材料、试剂和仪器

材料：人胚肾上皮细胞HEK-293株，含有VEGF基因启动子的重组质粒，均由四川大学生物医学材料工程研究中心提供；“3个藏药”所含有的17个化合物由西南交通大学医学院制备。

试剂：DMEM高糖培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）、双抗生素（100×penicillin-streptomycin）、Opti-MEM均由Gibco公司提供；磷酸缓冲液（PBS，成都哈里生物公司）；细胞培养板（Corning公司）；细胞培养皿（Thermo公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；G418（Amresco公司）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司），细胞增殖-毒性检测试剂盒（东仁化学＜上海＞公司）；荧光素酶检测试剂盒（Promega公司）；蛋白质浓度测定试剂盒（Thermo公司）。

仪器：MACO-15AC型二氧化碳培养箱（日本SANYO公司）；SW-CJ-2N型超净工作台（哈尔滨东联公司）；DSX-280A型灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；Centrifuge 5424／5415R型 离 心 机（Eppendorf）；XW-80A型涡旋仪（上海青浦沪西仪器厂）；DMIL型显微镜、DMI 4000B型显微镜均由Leica公司提供；Varioskan®Flash酶标仪（Thermo Scientific）。

1．2 方法

HEK-293细胞培养条件：使用DMEM高糖培养基，按体积加入10%胎牛血清和1%双抗生素，37℃，5%CO2，于恒温培养箱中培养。每36～48 h传代1次，取对数生长期的细胞备用。

细胞模型的构建和验证：将对数生长期、长势良好的HEK-293细胞接种到24孔板中，培养至细胞融合度达90%。使用荧光素酶活性分析系统，将含有VEGF启动子和Luc报告基因的pVEGF promoter-Luc质粒对HEK-293细胞进行转染。使用阳性药物脂多糖（存在于革兰阴性菌细胞壁上，可启动VEGF转录[7]）刺激转染质粒的HEK-293细胞（简称VEGF-293）和未转染质粒的HEK-293细胞，按Promega公司报告系统的标准操作方案检测荧光素酶的活性，以验证细胞模型的有效性。

待测化合物的处理：选取的17个化合物见表1。化合物均使用DMSO溶解为50 mmol／L的母液，于-20℃冰箱保存。根据需要，用DMSO稀释成不同浓度的待测液，备用。

表1 17种待测化合物信息

细胞毒性检测：每种化合物设置100，50，25，10μmol／L 4个浓度梯度。取对数生长期的VEGF-293细胞，以5×104的密度接种到96孔板中进行培养。24 h后，换成含有不同浓度药物的培养基处理细胞，设立DMSO（终体积0．1%）对照组和空白调零组，每组平行3个。培养24 h后，以CCK-8试剂盒检测，酶标仪测定吸光度，计算细胞存活率。以细胞存活率90%以上为安全浓度。

相对存活率=（A加药-A空白）／（A对照-A空白）×100%

荧光素酶分析：根据不同药物的安全浓度，采用1．2．4项方法处理细胞24 h。设计DMSO（终体积0．1%）对照组，每组平行3个。分别使用荧光素酶检测试剂盒检测总荧光素酶活性，BCA蛋白质测定试剂盒检测蛋白质总浓度。计算单位荧光素酶活性，并和对照组比较，得相对单位荧光素酶活性。

相对单位荧光素酶活性=（实验组荧光素酶活性／实验组蛋白质浓度）／（对照组荧光素酶活性／对照组蛋白质浓度）×100%。

1．3 统计学处理

同组数据采用方差分析。

2 结果

2．1 稳定细胞株的建立

质粒转染HEK-293细胞后，经G418培养基筛选25 d，可得稳定传代的细胞株。由图1可见，单克隆在逐渐增大。经转染重组后的细胞比普通的HEK-293细胞更脆弱，因此培养期间需要频繁观察生长状况，并及时更换新鲜培养基。第25天，细胞生长状态已趋于稳定，可用于冻存及扩大培养。

图1 转染质粒后不同天数的HEK-293细胞株（明场，×200）

转染后的细胞模型和未转染质粒的HEK-293细胞分别用阳性药物脂多糖处理，检测其荧光素酶强度。阳性药物组的荧光素酶活性为36．71±6．38，是空白组荧光素酶活性0．28±0．03的100倍以上（比值为131±27．73），表明该细胞模型可有效刺激相应具有生理活性的药物，证明该细胞模型可用于药物的筛选。

2．2 17个药物单体对细胞模型的抑制率

细胞毒性试验结果见图2。其中1～15号单体在100μmol／L浓度下，VEGF-293细胞的存活率均大于90%，表明在此浓度下安全。而16号和17号单体对VEGF-293细胞的存活率低于90%，说明毒性较大，其安全浓度均低于10μmol／L。故荧光素酶试验对1～15号单体均采用100μmol／L作为筛选浓度，对于16号和17号单体均采用10μmol／L作为筛选浓度。

图2 100μmol／L浓度下不同单体对VEGF-293细胞增殖率的影响

2．3 17种单体对于VEGF基因启动子的激活效果

结果见图3和表2。由图3可知，2，4，5，6，9，12号化合物对VEGF启动子的激活率超过150%，筛选结果呈阳性。其中，2，6，12的激活作用是阴性对照组的20倍以上。提示“3个藏药”在给药过程中，发挥的血管保护和再生作用可能主要和2，6，12号化合物有关。

图3 17个单体成分对VEGF基因启动子的作用

表2 各中药单体对基因转录活性的影响

阿魏酸、川芎嗪和芒果苷系“3个藏药”方中激活VEGF基因启动子作用有效的单体化合物，是其经典方中抗脑缺血的物质基础。阿魏酸具有抗氧化、抗血栓和调血脂的作用，临床应用富含阿魏酸的当归、升麻等常用于血管性疾病；川芎嗪具有改善微循环、降低外周阻力、扩张血管等药理作用，均与VEGF基因的激活相关。芒果苷有潜在开发为血管类新药的可能。

3 讨论

藏医药学在约2 300年前发源于干旱、缺氧的青藏高原，在缺血、缺氧疾病方面有独到的临床经验。藏医学中，脑缺血被称为“白脉病”，治疗的主要内服方剂有二十五味珍珠丸、如意珍宝丸、十五味沉香丸、十三味鹏鸟丸等[1，8]。现代药理学的研究已证实，藏药在治疗脑缺血方面有显著疗效，但藏药处方庞大，成分复杂，如何确定庞杂药材成分中的微量有效成分，本研究中提出拟借助分子生物学手段建立一种准确、快速的方法，可作为新药筛选的工具，也为藏药的物质基础研究提供了良好的手段。VEGF的调控范围不仅和脑缺血后的损伤恢复有关，也对应了“3个藏药”的治疗范围。因此以此作为靶基因来寻找复杂中药体系中的有效成分，不但可用于药效和成分的研究，还可为临床定向治疗提供帮助。

本研究中构建了脑缺血相关基因的药物筛选模型，并通过阳性药物验证了其有效性。且用该模型对“3个藏药”中含有的主要成分进行筛选，找到了其中VEGF基因启动子激活作用最有效的几种化学成分。该结果既为藏药的药理作用、信号通路等的进一步深入研究提示了方向，又为藏药质量标准控制提供了参考。此外，现有体外细胞筛选模型多以受体的结合位点或转录因子等作为研究对象。这种以单一靶点的模型只能得到针对某一个单独位点的有效物质。而本研究中采用能否激活基因启动子的序列作为筛选条件，基因的启动子序列中往往含有多个不同的转录因子结合位点，因此本研究的筛选模型可筛出能作用于目标基因表达的一大类物质，不仅可保证该基因作用的特异性，也能大大地扩展筛选范围。

本研究关于藏药药效的探索只停留在某种化合物可激活启动子的层面上，尚不够深入。首先，VEGF受到许多因子的调控[9]，待测药物通过哪一个结合位点，或是怎样的途径来激活启动子，仍需要对机制做更详细地研究；其次，VEGF有种类繁多的靶基因，不仅具有促进血管再生的功能，也能通过影响其他因子来控制神经再生、缺氧应答等[10-11]。本研究中仅能得知该化合物可激活该基因的启动子，其具体的药效还有待进一步研究。本研究中虽然证明了该化合物能激活启动子，但无法得知该基因mRNA的量有无上升，以及能否进一步体现在蛋白质表达层面上。因此，本研究中只是为中药复杂体系的有效物质寻找提供一个初筛的手段，仍有许多改进完善和进一步研究的空间。