健脾益肺汤抑制NF-κB/STAT3信号通路改善哮喘模型大鼠气道炎症及气道重塑作用研究*

张文斌 王 杰 王 玮 魏恩垚 刘 煌 李 芹

（重庆市中医院，重庆 400021）

全球约有3亿人患有哮喘，气道平滑肌细胞（ASMCs）被认为是气道紊乱、狭窄和阻塞的主要效应细胞，ASMCs通过调节气道炎症和重塑反应参与哮喘的发病机制［1-2]。健脾益肺汤是临床用于治疗慢性阻塞性肺疾病（COPD）的中药方剂，也有治疗哮喘的作用，但其机制也未完全确定［3]。 核因子（NF）-kappaB（NF-κB）被认为是炎症的关键调节器，激活NF-κB在哮喘气道炎症中起着重要的作用［4]。信号转导及转录激活因子3（STAT3）是一种重要的转录因子，通过诱导细胞因子、黏附分子和趋化因子的表达，在调节炎症反应中起着至关重要的作用［5]。STAT3通过改变Th2细胞募集和效应功能对哮喘的过敏性炎症反应起着不可或缺的作用［6]。研究发现，健脾益肺汤能抑制许多相关的炎症反应［7]。 然而，健脾益肺汤与 NF-κB/STAT3信号通路在哮喘中的关系仍是未知的。因此，本文通过探讨健脾益肺汤能否抑制NF-κB/STAT3信号通路，为健脾益肺汤治疗哮喘提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取30只8周龄SD大鼠（由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，许可证号：SYXK：2010-0057，动物合格证编号：0001507），雌雄各半，体质量 200～240 g，动物饲养在温度 22～24℃、相对湿度为40%～70%的SPF环境中自由进食和饮水，适应性喂养1周后进行实验。

1.2 试药与仪器 1）试药：健脾益肺汤（黄芪30 g，茯苓、炒白术、炒谷芽各15 g，人参、陈皮、桔梗各10 g，升麻、甘草6 g，砂仁5 g，购于重庆市中医院中药房，生药3.0 g/mL）；卵蛋白（VOA）和氢氧化铝凝胶（美国 Sigma公司）；γ 干扰素（IFN-γ）、白细胞介素（IL-4、IL-6 和IL-13）ELISA试剂盒 （上海酶联生物科技有限公司）；鼠抗 NF-κB、p-NF-κB、STAT3 和 p-STAT3 单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗鼠IgG二抗和鼠抗GADPH单克隆抗体（武汉艾美捷科技有限公司）。2）仪器：雾化器WH-2000（广东粤华公司）；HBS-1096B酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；ASP300S组织脱水机、EG1150组织包埋机、RM2255全自动轮转切片机 （德国Leica公司）；BioDoc-It Imaging System凝胶成像仪 （美国UVP公司）；BIO-RAD垂直电泳仪（美国BIO-RAD公司）；ECLIPSE LV150L正立显微显微镜（日本Nikon公司）。

1.3 分组及造模 将大鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组和健脾益肺汤组，每组10只。采用OVA联合氢氧化铝凝胶多次激发致敏法造模。模型组和健脾益肺汤组在第1日和第8日肌注2%OVA 1 mL，腹腔注射氢氧化铝凝胶（200 ng/mL）1 mL，第15日用雾化器泵入1%OVA溶液0.2 mL，每日1次，持续至第21日。对照组用0.9%氯化钠注射液替代OVA和氢氧化铝凝胶，其他操作与模型组和健脾益肺汤组相同。以大鼠出现腹肌收缩、呼吸急促、咳嗽等及血中嗜酸粒细胞百分比显著增高确定模型成功［8]。

1.4 干预方法 健脾益肺汤生药用800 mL水浸泡2 h，煮沸30 min，过滤。药渣加600 mL水继续煎煮20 min，过滤。合并两次滤液，浓缩至约生药含量3 g/mL的溶液。在造模结束后健脾益肺汤组以9 g/（kg·d）进行灌胃，每日1次，持续30 d。对照组和模型组给予3 mL/（kg·d）0.9%氯化钠注射液灌胃，每日 1 次，持续30 d。末次给药1 h后处死大鼠后进行相关检测。

1.5 标本采集与检测 1）大鼠肺组织切片观察。用右肺上叶进行甲醛固定，经脱水、包埋，切成3 μm厚切片，进行苏木精-伊红（HE）染色，观察肺组织学变化。用Image-pro plus 6.0图像分析软件测量肺内气管壁厚度和平滑肌厚度。2）肺泡灌洗及蛋白、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-13含量的测定。结扎右侧主支气管近端和气管远端，在气管结扎下端用0.3 mL预冷0.9%氯化钠注射液进行左肺灌洗，重复3次，回收支气管肺泡灌洗液，离心取上清，根据BCA蛋白测定试剂盒说明书检测支气管肺泡灌洗液中总蛋白含量；根据ELISA试剂盒说明书检测支气管肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-13的含量。3）Western blotting法检测NF-κB、p-NF-κB、STAT3和 p-STAT3蛋白表达水平。取右肺中叶进行研碎，进行蛋白质提取；调整蛋白浓度用SDS-PAGE凝胶进行电泳，每孔上样量 20 μg，然后将蛋白转膜到PVDF膜上，加入封闭液封闭1 h，孵育一 抗 ［NF-κB（1∶1 000）、p-NF-κB（1∶500）、STAT3（1∶500）、p-STAT3（1∶500）、GADPH（1∶4 000）]，4 ℃孵育过夜 12 h，孵育二抗［山羊抗鼠（1∶5 000）]2 h，用ECL显色液显色后进行曝光显影，采集图像，对免疫印迹条带灰度值并进行分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。实验结果以（±s），用方差分析进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

表1 各组大鼠气管形态学变化比较（μm，±s）

表1 各组大鼠气管形态学变化比较（μm，±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。 下同

组 别 n 气管壁厚度 平滑肌厚度对照组 10 33.12±4.38 13.52±0.94模型组 10 70.64±5.09* 25.66±1.30*健脾益肺汤组 10 42.40±4.07*△ 17.63±1.08*△

图1 各组大鼠气管病理变化（HE染色，40倍）

2.1 各组大鼠气管病理变化比较 见表1，图1。与对照组比较，模型组大鼠气管壁厚度和平滑肌厚度增加（P＜0.05）；给予健脾益肺汤干预后，大鼠气管壁厚度和平滑肌厚度降低（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠肺泡灌洗液中蛋白和IFN-γ表达比较见表2。与对照组比较，模型组大鼠肺泡灌洗液中蛋白增加，IFN-γ降低（P＜0.05）；给予健脾益肺汤干预后，大鼠泡灌洗液中蛋白降低，IFN-γ增加（P＜0.05）。

表2 各组大鼠肺泡灌洗液中蛋白和IFN-γ表达比较（±s）

表2 各组大鼠肺泡灌洗液中蛋白和IFN-γ表达比较（±s）

组 别 n 蛋白含量（mg/L） IFN-γ（pg/mL）对照组 10 104.03±10.16 147.54±11.89模型组 10 343.68±18.47* 96.94±10.35*健脾益肺汤组 10 168.60±17.55*△ 115.60±14.16*△

2.3 各组大鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-6和IL-13表达比较 见表3。与对照组比较，模型组大鼠肺泡灌洗液中 IL-4、IL-6和 IL-13 增加（P＜0.05）；给予健脾益肺汤干预后，大鼠泡灌洗液中IL-4、IL-6和IL-13降低（P＜0.05）。

表3 各组大鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-6和IL-13表达比较（pg/mL，±s）

表3 各组大鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-6和IL-13表达比较（pg/mL，±s）

组 别 n IL-4对照组 10 37.90±5.74模型组 10 106.61±9.13*健脾益肺汤组 10 75.86±6.49*△IL-6 IL-13 26.47±3.52 52.64±4.33 144.30±20.56*227.03±14.67*81.83±6.80*△ 94.31±8.65*△

2.4 各组大鼠肺组织中 NF-κB、p-NF-κB、STAT3 和p-STAT3表达比较 见表4，图2。与对照组比较，模型组大鼠肺组织中 NF-κB、p-NF-κB、STAT3 和 p-STAT3增加（P＜0.05）；给予健脾益肺汤干预后，大鼠肺组织中 NF-κB、p-NF-κB、STAT3 和 p-STAT3 降低（P＜0.05）。

图2 各组大鼠肺组织中NF-κB、p-NF-κB、STAT3和p-STAT3表达条带

3 讨 论

吸入糖皮质激素是一种著名的治疗哮喘的疗法，然而，这种策略可以使骨密度降低［9]。因此，探索更有效的治疗哮喘迫在眉睫。健脾益肺汤采用“君臣佐使”原则制定，以黄芪、茯苓为君，配以臣药炒白术、炒谷芽、人参，并佐以陈皮、桔梗、升麻、甘草、砂仁等治疗。研究发现，ASMCs更接近哮喘的上皮，这提示在哮喘中经历了ASMCs迁移过程［2]。本研究结果显示，健脾益肺汤能降低哮喘大鼠气管壁厚度和平滑肌厚度，减少肺泡灌洗液中蛋白的分泌，可发挥治疗哮喘的功效。有研究证明，健脾益肺汤能降低TNF-α和IL-8的水平来保护大鼠肺组织不受脂多糖的影响，但健脾益肺汤对肺组织的保护作用机制尚不清楚。

表4 各组大鼠肺组织中NF-κB、p-NF-κB、STAT3和p-STAT3 表达比较（±s）

表4 各组大鼠肺组织中NF-κB、p-NF-κB、STAT3和p-STAT3 表达比较（±s）

组 别 n NF-κB p-NF-κB STAT3 p-STAT3对照组 10模型组 10 0.39±0.04 0.27±0.03 0.53±0.06 0.19±0.01 1.24±0.09*0.70±0.06* 1.04±0.09* 0.66±0.07*健脾益肺汤组 100.62±0.05*△ 0.48±0.05*△ 0.62±0.03*△ 0.30±0.04*△

Th1/Th2失衡在哮喘的发生发展中起着重要作用［10]。Th2细胞是哮喘发病机制的关键T辅助细胞亚群。IL-4触发Th2细胞的分化，导致其效应细胞因子IL-4、IL-6和IL-13的增强［11]。Th2细胞因子负责诱导过敏原特异性免疫球蛋白E（E-cadherin）的产生和炎症介质的释放［12]。Th1细胞可抑制Th2反应，IFN-γ是由Th1细胞分泌的重要细胞因子，其表达水平增加能抑制炎症进展［13]。本研究结果显示，健脾益肺汤能抑制IL-4、IL-6和IL-13的分泌，增加IFN-γ的水平，发挥治疗哮喘的功能。

细胞因子包括TNF-α和IL-6等通过受体启动信号级联，导致转录因子的激活和靶基因的表达。NF-κB和STAT3都是潜在的细胞质转录因子或细胞因子刺激激活的因子，调节编码免疫相关蛋白的基因转录。在人类中，激活NF-κB二聚体主要由Rel家族蛋白p50和p65子单元。NF-κB与启动子中相应的κB位点结合以及靶基因的增强子，NF-κB发生磷酸化 （p-NF-κB）并激活通路。抑制NF-κB信号与调控Th1/Th2失衡有关［14]。 此外，NF-κB 信号失活抑制 ASMCs增殖和迁移［15]。通过抑制NF-κB减轻人间质细胞炎症反应，但在哮喘中NF-κB信号仍然未知。因此，我们制备大鼠哮喘模型，探讨NF-κB与哮喘的关系，结果显示，健脾益肺汤能显著抑制NF-κB和p-NF-κB的水平，证明健脾益肺汤能抑制NF-κB活性。二硫氨基甲酸肽吡咯烷（PDTC）是一种NF-κB抑制剂，可以抑制ASMCs的过度增殖，也间接证明了NF-κB在哮喘发病过程中的作用［16]。STAT3 和 NF-κB 一样，参与激活免疫反应。在接收STAT3信号刺激后发生活化，生成磷酸化STAT3（p-STAT3）。研究表明，在小鼠哮喘模型中，过敏性炎症需要STAT3。同时，STAT3抑制可以防止肺部炎症和IL-13细胞因子的分泌［17]。本研究结果也表明健脾益肺汤能抑制STAT3活性。

综上所述，健脾益肺汤通过抑制NF-κB/STAT3信号通路，减轻大鼠炎性反应，发挥哮喘气道炎症及气道重塑改善作用，是哮喘治疗的一种潜在候选药物。