Notch信号通路经ROCK2对缺氧/复氧诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响

易松　杨丹　幸志强

[摘要] 目的 探讨Notch信号通路经ROCK2对大鼠心肌细胞缺氧/复氧诱导H9c2心肌细胞的凋亡影响。 方法 选择SD大鼠乳鼠180只，分为6组，检测Hes1的表达、心肌细胞活力、心肌细胞乳酸脱氢酶释放情况、心肌细胞凋亡情况以及NICD、Bcl2、Caspase3以及Hes1表达水平。 结果 SI/R组OD值相比对照组明显下降（P<0.05）;Jagged1+SI/R组与SI/R组、对照组对比，存在明显差异（P<0.05）;Jagged+DAPT+SI/R组OD值与Jagged1+SI/R組对比，存在明显差异（P<0.05）;Jagged1组、DAPT组OD值与对照组对比，均未见显著差异（P>0.05）。SI/R组、Jagged1+SI/R组、Jagged+DAPT+SI/R组的LDH释放率、细胞凋亡率相比对照组均有明显上升（P<0.05）;SI/R组、Jagged1+SI/R组、Jagged+DAPT+SI/R组经处理后的Notch1、Hes1、Bcl2均有显著下降，而Caspase3表达显著上升（P<0.05）。结论 Notch 信号通路在心肌缺血/再灌注的过程中发挥着重要调控作用，对诱导H9c2心肌细胞凋亡具有重要影响，且激活Notch信号通路能起到抗缺血/再灌注损伤的效果。

[关键词] Notch信号通路;ROCK2;心肌缺血/再灌注;H9c2心肌细胞凋亡

[中图分类号] R363          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）10-0038-04

Effect of Notch signaling pathway on apoptosis of H9c2 cardiomyocytes induced by hypoxia/reoxygenation by ROCK2

YI Song   YANG Dan   XING Zhiqiang

Department of Cardiology， Yichun People's Hospital in Jiangxi Province， Yichun   336000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Notch signaling pathway on the apoptosis of H9c2 cardiomyocytes induced by hypoxia/reoxygenation in rat cardiomyocytes via ROCK2. Methods A total of 180 SD neonatal rats were selected as the study materials and divided into 6 groups. The expression of Hes1， myocardial cell viability， release of cardiomyocyte lactate dehydrogenase， cardiomyocyte apoptosis and NICD， Bcl2， Caspase3 and Hes1 expression levels were detected. Results The OD value of SI/R group was significantly lower than that of the control group（P<0.05）， the OD value of Jagged1+ SI/R group was significantly different from that of the SI/R group and the control group（P<0.05）. There was significant difference in the OD value between Jagged+DAPT+SI/R group and the Jagged1+SI/R group（P<0.05）. There was no significant difference in the OD value between the control group and Jagged1 group， the DAPT group（P>0.05）. The LDH release rate and apoptosis rate of SI/R group， Jagged1+SI/R group and Jagged+DAPT+SI/R group were significantly higher than those of the control group（P<0.05）. The levels of Notch1， Hes1 and Bcl2 in the SI/R group， Jagged1+SI/R group and Jagged+DAPT+SI/R group were significantly decreased， while the expression of Caspase3 was significantly increased（P<0.05）. Conclusion Notch signaling pathway plays an important role in the regulation of myocardial ischemia/reperfusion， and has an important effect on the induction of H9c2 cardiomyocyte apoptosis. Activation of Notch signaling pathway can inhibit ischemia/reperfusion injury.

[Key words] Notch signaling pathway; ROCK2; Myocardial ischemia/reperfusion; H9c2 cardiomyocyte apoptosis

缺血性心脏病是当前一类严重危害人类身体健康的疾病。在我国，有超过2000万缺血性心脏病患者，且每年以100万例的速度在不断增长[1-2]。此类患者可通过溶栓治疗、经皮导管冠脉介入术治疗（PCI）等方法以恢复心肌血液供应[3]。但临床发现，缺血心肌组织在重新恢复血液供应后，常出现继发、加重心肌组织的损伤现象，即易发生缺血/再灌注损伤。对于心肌组织的缺血/再灌注，受多信号通路以及细胞因子的影响，是一项复杂的生物反应过程。当前对于心肌组织的缺血/再灌注相关的信号转导通路研究是一项重点研究内容。研究通过Notch信号通路作为切入点，通过动物实验建立大鼠乳鼠心肌细胞缺血/再灌注模型，探讨Notch信号通路经ROCK2对大鼠心肌细胞缺氧/复氧诱导H9c2心肌细胞的凋亡影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择由本院实验动物中心提供SD大鼠乳鼠180只，纳入乳鼠雌雄不拘，育龄1～2 d，体重1.3～1.8 g，批号：20160221。

1.2主要试剂

DMEM细胞培养基、胎牛血清均为美国Gibco公司生产;胶原酶Ⅰ、HEPES、5-溴脱氧尿苷、2-deoxy-D-glucose、5-二苯基四氮唑嗅盐、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2、MTT均为美国Sigma公司生产;兔抗人Caspase3抗体、兔抗人Bcl2抗体均为美国Cell signaling公司生产;兔抗人Notch1单克隆抗体为美国Abcom公司生产;Notch信号通路的特异性抑制剂DAPT由德国Merck公司生产;激活Notch信号通路的重组大鼠Jagged1蛋白由美国R&D公司生产;LDH-释放检测试剂盒由南京建成生物制剂公司生产;TUNEL-凋亡检测试剂盒由德国Roche公司生产。

1.3 主要仪器

超净工作台;CO2细胞培养箱;Olympus倒置显微镜;ZW-A微量振荡器;低转速离心机;Olympus荧光显微镜。

1.4 方法

（1）培养乳鼠原代心肌细胞。应用医用酒精对SD大鼠乳鼠进行消毒后，于超净工作台内无菌条件取下小鼠心脏，置于PBS中剪碎，在添加胶原酶Ⅰ的PBS进行3次重复消化，每次持续5 min。将获得细胞悬液置于DMEM（含有10%血清）中，经1000 r/min离心处理5 min，弃去上清，通过血清培养基进行细胞重悬处理，经培养箱培育后通过差速贴壁法对心肌细胞进行纯化，获得纯化心肌细胞中添加Brdu，以抑制成纤维细胞的增长。心肌细胞接种至6、24、96孔培养板，加入载玻片进行免疫荧光检测。

（2）建立乳鼠心肌細胞SI/R模型。参考文献报道[4]的模型建立方法建立心肌细胞SI/R损伤模型。再灌注条件：正常DMEM，经37℃孵育处理4 h。于倒置显微镜下对心肌细胞形态变化进行观察。

（3）试验分组。将180只小鼠均分为6组，每组30只。6组分别为一般对照组、SI/R组、Jagged1+SI/R组、Jagged+DAPT+SI/R组、DAPT组以及Jagged1组。一般对照组应用正常DMEM进行7 h培养;SI/R组经正常培养1 h+模拟缺血培养2 h+正常DMEM再灌注处理4 h;Jagged1+SI/R组经添加Jagged1（6.8 μM）DMEM孵育1 h+模拟缺血培养2 h+正常DMEM再灌注处理4 h;Jagged+DAPT+SI/R组经添加DAPT（31.25 nM）以及Jagged1（6.8 μM）DMEM孵育1 h+模拟缺血培养2 h+正常DMEM再灌注处理4 h;DAPT组应用添加DAPT（31.25 nM）DMEM孵育1 h+正常DMEM孵育6 h;Jagged1组应用添加Jagged1（6.8 μM）孵育1 h+正常DMEM孵育6 h。

（4）各组心肌细胞活力检测。各组分组处理后，每孔添加10 μL 的MTT溶液，置于37℃下孵育4 h，每孔再添加100 μL二甲基亚砜，震荡处理15 min。置于酶标仪490 nm波长下检测各孔的光密度值（OD）。

（5）心肌细胞乳酸脱氢酶释放试验。收集各组细胞培养液置于4℃冰箱中保存。给细胞添加相同体积裂解液，收集处理后的裂解液，于4℃下离心处理获得上清液，对培养液与裂解液中的心肌细胞乳酸脱氢酶（LDH）活性进行检测，计算样本LDH的释放量。其中，LDH释放量=培养液中LDH测定值/（培养液、裂解液的LDH测定总值）×100%。

（6）心肌细胞凋亡的检测。在进行接种前，将盖玻片置于培养孔中进行爬片细胞的培养;实验结束后取出盖玻片，经浓度100%的冷丙酮置于-20℃下固定20 min，自然晾干。心肌细胞凋亡的检测参考试剂盒的说明书进行操作。检测后置于荧光显微镜下观察细胞凋亡的情况，以细胞核当中存在绿色荧光颗粒记录为TUNEL染色阳性，即该细胞为凋亡细胞，对每张切片均随机取5个及以上高倍视野，计算心肌细胞核的凋亡率。其中，凋亡率=（观察凋亡细胞数/总细胞数）×100%。

（7）Notch1、Hes1、Bcl2以及Caspase3表达的检测。取小鼠心肌组织100 mg，置于匀浆器中，添加组织裂解液进行匀浆，于冰上孵育处理1 h。孵育后经1200 r/min离心处理15 min，取上清液。取部分用BCA法对蛋白质进行定量分析，留取部分上清液添加5X上样缓冲液经沸水蒸煮处理7 min获得蛋白质样品。依据第三版《分子克隆》制备蛋白电泳凝胶，控制电压80 V，于甘氨酸电泳缓冲液当中电泳90 min。电泳结束后装配转膜装置进行转膜处理60～120 min，应用去离子水将硝酸纤维素膜进行冲洗并置入丽春红中5 min，应用去离子水冲洗，标记蛋白marker相应条带。剪下32 KD的Hes1、42 KD（β-actin）、120 KD的NICD膜。经5%的脱脂奶粉封闭处理1 h，加入Hes1一抗（1：1000稀释）、β-actin一抗（1：2000稀释）、ICD一抗（1：1000稀释），室温下孵育处理1 h。经TBST洗膜2次以及TBS洗膜1次，加入二抗（1：1000稀释），室温下孵育处理1 h，经TBST洗膜2次以及TBS洗膜1次，ECL发光液曝光，分析蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法

应用SPSS 16.0统计软件处理数据。各组Western blotting的信号强度以对照组为基础强度，强度100%，检测计量资料以均数±标准差（x±s）描述，进行方差分析，组间两两对比行LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌细胞活力（OD值）检测结果

一般对照组的心肌细胞OD值为（0.73±0.09）;SI/R组OD值为（0.41±0.07），相比对照组明显下降（P<0.05）;Jagged1+SI/R组OD值为（0.53±0.06），相比SI/R组或对照组差异显著（P<0.05）;Jagged+DAPT+SI/R组OD值（0.23±0.06）（vs Jagged1+SI/R组，P<0.05）;Jagged1组OD值为（0.74±0.09），DAPT组OD值为（0.78±0.14），与对照组相比均未见显著差异（P>0.05）。

2.2 各组LDH释放试验检测结果

细胞LDH释放量检测可用于确定细胞损伤的程度。对照组的LDH释放率为（11.19±2.13）%;SI/R组LDH释放率为（36.23±3.33）%，显著高于对照组（P<0.05）;Jagged1+SI/R组LDH释放率为（28.29±3.16）%，显著高于对照组，低于SI/R组（P均<0.05）;Jagged+DAPT+SI/R组LDH释放率为（49.62±3.40）%，与Jagged1+SI/R组存在显著差异（P<0.05）;Jagged1组LDH释放率为（11.23±2.26）%，DAPT组LDH释放率为（11.37±2.41）%，與对照组相比均未见显著差异（P>0.05）。

2.3 各组心肌细胞凋亡检测结果

对照组心肌细胞凋亡率为（7.13±0.72）%;SI/R组细胞凋亡率为（34.24±3.55）%，显著高于对照组（P<0.05）;Jagged1+SI/R组细胞凋亡率为（23.46±11.41）%，相比SI/R组显著降低（P<0.05）;Jagged+DAPT+SI/R组细胞凋亡率为（46.33±6.26）%，显著高于其他各组（P<0.05）;Jagged1组细胞凋亡率为（7.18±0.82）%，DAPT组细胞凋亡率为（7.10±0.65）%，与对照组相比均未见显著差异（P>0.05）。

2.4 各组Notch1、Hes1、Bcl2以及Caspase3的表达检测结果

各组Notch1、Hes1、Bcl2以及Caspase3的表达检测结果见表1。SI/R组、Jagged1+SI/R组、Jagged+DAPT+SI/R组经处理后Notch1、Hes1、Bcl2均显著下降，Caspase3表达显著上升（P<0.05）。

3讨论

Notch信号通路是作为心血管系统的发生、发育、病理以及生理过程当中的一种基本的信号通路，该通路具有促进干细胞的分化与增殖，促进损伤细胞的再生作用[4-6]。有研究提示，Notch信号通路在缺血/再灌注的过程中发挥一定的作用[7]。当前研究发现，心梗后晚期的 Notch信号通路中，Notch1分子胞内区的关键分子NICD在心梗边缘区（即在缺血但未坏死的区域内）的表达出现显著提升;且在Notch 信号通路激活后，心梗恢复期心脏功能出现明显的改善[8-9]。Gude NA等[10]研究提示，Notch信号通路可能在心肌的缺血损伤过程以及心肌保护过程均发挥出重要的调控作用。Notch信号通路与NF-κB及PI3K/Akt等信号通路通过分子网络互相间影响，NF-κB以及PI3K/Akt等相关信号通路已被研究证明为心肌缺血/再灌注过程发挥重要作用的通路，不少研究均提示，与NF-κB及PI3K/Akt相关的Notch 信号通路也可能通过多信号通路的级联效应对心肌缺血/再灌注过程起到调控作用[11]。不少学者基于相关通路的研究认为，心肌缺血/再灌注损伤中，Notch信号通路的激活或发挥出重要的调控作用[12-14]。

本研究主要以通过动物实验建立大鼠乳鼠心肌细胞缺血/再灌注模型，探讨Notch信号通路经ROCK2对大鼠心肌细胞缺氧/复氧诱导H9c2心肌细胞的凋亡影响，SD大鼠乳鼠心肌细胞模型对于Notch信号通路的相关分子Notch与Hes1在正常心肌细胞、缺氧/复氧心肌细胞中的表达明确，其相对于人心房肌标本实验可有效避免临床因素的影响[15]。本研究纳入小鼠180只，分6组处理，检测Hes1的表达、心肌细胞活力、心肌细胞乳酸脱氢酶释放情况、心肌细胞凋亡情况以及NICD、Bcl2、Caspase3以及Hes1表达水平。结果提示，各组心肌细胞活力（OD值）检测中，SI/R组、Jagged1+SI/R组、Jagged+DAPT+SI/R组明显下降，而Jagged1组、DAPT组与对照组均无明显差异，研究排除了Jagged1与DAPT对实验的影响。而LDH释放率、细胞凋亡率在SI/R组、Jagged1+SI/R组、Jagged+DAPT+SI/R组均有明显上升，Notch1、Hes1、Bcl2、Caspase3表达以对照组检测结果为100.00%，SI/R组、Jagged1+SI/R组、Jagged+DAPT+SI/R组经处理后Notch1、Hes1、Bcl2均有显著下降，Caspase3表达显著上升（P<0.05）。实验结果显示，通过激活Notch信号通路能有效减轻心肌细胞缺血/再灌注损伤，激活Notch信号通路后，心肌细胞的活力增加，且LDH的释放率降低，细胞凋亡率降低，且抗凋亡蛋白-Bcl2的表达水平升高，凋亡蛋白Caspase3的表达水平下降;通过抑制Notch信号通路能加重缺血/再灌注损伤现象，实验结果显示，抑制Notch信号通路后心肌细胞的活力受到抑制，LDH释放率升高，细胞凋亡率升高，抗凋亡蛋白-Bcl2的表达水平降低，凋亡蛋白Caspase3的表达水平提升。

综上所述，本研究提示Notch 信号通路在心肌缺血/再灌注的过程中发挥着重要调控作用，对诱导H9c2心肌细胞凋亡具有重要影响，且激活Notch 信号通路能起到抗缺血/再灌注损伤的效果。

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