医院制剂肺炎合剂质量控制的方法研究

张海波， 谢伟娜， 唐国华， 陈 迹, 胡君萍， 杨建华,

(新疆医科大学1第一附属医院药学部， 乌鲁木齐 830054； 2药学院， 乌鲁木齐 830011)

肺炎合剂是新疆医科大学第一附属医院在治疗小儿肺炎经验方的基础上研制开发的院内制剂，由麻黄、杏仁、石膏、甘草等8味中药制成，具有清肺平喘、消炎止咳、辛凉解表的功效[1]，临床上主要用于小儿急性肺炎及急性支气管炎等病症的治疗。方中麻黄为君药，性辛温，具有解表散邪、宣肺平喘的功效，主要活性成分为盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱，具有镇咳、祛痰、平喘、抗炎、兴奋中枢等作用[2-3]。现行质量标准仅对肺炎合剂相对密度、 pH等指标进行了检查[4]，定性鉴别及定量控制指标缺失，不能实现对该制剂全面有效的质控。本研究采用薄层色相(TLC)法对君药麻黄中盐酸麻黄碱进行了鉴别，采用高效液相色谱(HPLC)法对方中君药麻黄中主要活性成分盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱进行了含量测定，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器BP211D型分析天平(德国Sartorius公司)，DGU-20A5R型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，SPD-M20A型检测器(日本岛津公司)，LabSolution液相工作站(日本岛津公司)，FJY1002-4VF基因研究型超纯水机(青岛富勒姆科技有限公司)，LG10-2.4A型高速冷冻离心机(中科中佳科学仪器有限公司)，MS 3 basic型涡旋振荡器(德国IKA公司)，DZKW型4孔电子恒温水浴锅(北京永兴明医疗仪器厂)，KQ-200VDB型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)，FE20型pH计(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 试药盐酸麻黄碱(中国药品生物制品检定所，批号：0090-9801)，盐酸伪麻黄碱(国家麻醉品实验室，批号：1237-9601)；甲醇(美国Fisher公司，批号：184267)，浓氨水(乌鲁木齐西北化学品厂，批号：000713)，磷酸(天津市北联精细化学品开发有限公司，批号：141020)，肺炎合剂(新疆医科大学第一附属医院自制，批号：180521、180524、180530)，肺炎合剂阴性样品(按处方制备缺麻黄样品，实验室自制)，试验用水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 麻黄的薄层鉴别取肺炎合剂20 mL，用浓氨水调pH至11，加入三氯甲烷30 mL，加热回流1 h，放至室温，转移至分液漏斗中，用三氯甲烷反复萃取，将萃取液转入分液漏斗中，取三氯甲烷层，蒸干，残渣用甲醇 2 mL 溶解，充分振荡，滤过，即得供试品溶液。取肺炎合剂阴性样品，按上述方法制备即得阴性供试品溶液。称取盐酸麻黄碱对照品适量，用甲醇溶解制得浓度为1.10 mg/mL对照品溶液。分别吸取肺炎合剂阴性供试品溶液、盐酸麻黄碱对照品溶液、肺炎合剂供试品溶液各 5 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以氯仿-甲醇-浓氨试液 (20∶5∶0.5) 为展开剂展开，取出晾干，喷以 2% 茚三酮乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，可见光下检。样品色谱中在与盐酸麻黄碱对照品相应的位置上(Rf=0.51)显示相同颜色的的斑点，斑点清晰，肺炎合剂阴性样品在相应的位置上无斑点。

2.2 盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量测定

2.2.1 色谱条件 采用 Shim-pack GIST C18-HP 色谱柱(150 mm×2.1 mm, 3 μm，日本岛津公司)，以甲醇(A)和0.1% 磷酸溶液(B，含0.1%三乙胺)为流动相，梯度洗脱(0～10 min，5% A；10～15 min，5%→90% A；15～20 min，90% A；20～25 min，90%→5% A；25～30 min，5% A)，检测波长 210 nm，流速 0.3 mL/min，柱温 35℃，进样量 5 μL。在此条件下，肺炎合剂中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱与其他成分分离效果良好，理论板数均>4 000。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别称取盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品10 mg，置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品储备液，分别吸取对照品储备液适量，置10 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，得到盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱质量浓度分别为552、558 μg/mL的混合对照品储备液。将该混合对照品储备液进行逐级稀释，即得不同浓度混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取肺炎合剂10 mL置于具塞锥形瓶中，用浓氨水调pH为11，加入20 mL 三氯甲烷超声(100 W，35 kHz)提取3次，每次30 min，合并三氯甲烷提取液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，经微孔滤膜(0.22 μm)滤过，即得供试品溶液。

2.2.4 阴性供试品溶液的制备 取肺炎合剂阴性样品，按 “2.2.3” 项下方法制备，即得阴性供试品溶液。

2.2.5 阴性干扰试验 按“2.2.1”项下色谱条件分别测定盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱混合对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液，结果阴性供试品溶液与盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱混合对照品溶液色谱峰无干扰，见图1-3。

图1 盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱混合对照品HPLC色谱图

2.2.6 回归方程的建立 分别吸取 “2.2.2” 项下不同浓度混合对照品溶液 5 μL，按 “2.2.1” 项下色谱条件测定，以进样浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，盐酸麻黄碱的回归方程为：Y=21 521X-408 921，r=0.999 4，盐酸伪麻黄碱的回归方程为：Y=21 911X-420 875，r=0.999 8，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱进样浓度分别在 8.62～138.00、8.72～140.00 μg/mL 的范围内线性关系良好。

2.2.7 精密度试验 取同一份供试品溶液，连续进样6次，测定盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积， RSD分别为4.9%、2.4%，表明仪器精密度良好。

图2 肺炎合剂HPLC色谱图

2.2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在 0、4、8、16、24 h 进样分析，测定盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积， RSD分别为6.3%、2.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

图3 阴性供试品HPLC色谱图

2.2.9 重复性试验 取同一批肺炎合剂5份，按“2.2.3”项下方法，制备成供试品溶液，进样测定盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰面积，RSD分别为6.5%、7.0%，表明该方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 量取已测得含量的肺炎合剂5 mL共9份，分别加入盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品溶液适量，每3份加入相同量，按“2.2.3”项下方法制备供试溶液，按“2.2.1”项下色谱条件下进行测定，计算加样回收率，表明该方法回收率良好，见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=3)

2.2.11 样品含量测定 取肺炎合剂，按“2.2.3”项下方法制备肺炎合剂供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件下进行测定，用外标法计算3批肺炎合剂中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量，见表2。

表2 肺炎合剂中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量(μg/mL， n=3)

3 讨论

肺炎合剂中君药麻黄的主要活性成分是盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱，为苯丙胺类生物碱，多数以盐的形式存在于植物中，当其处于游离状态时具有良好的脂溶性，采用亲脂性有机溶剂提取时，必须先用石灰乳、碳酸钠溶液或稀氨水等碱水将生物碱由盐的形式碱化为游离型生物碱，再用氯仿、二氯甲烷或苯等亲脂性有机溶剂萃取[5]。本研究在参考文献[6]的基础上，在样品前处理过程中，在肺炎合剂中先加入浓氨水调pH至11充分碱化，加入三氯甲烷萃取，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱提取效果较好。

盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱是一对差向异构体，而薄层色谱分离能力有限，无法实现对2种化合物的有效分离，因此在薄层鉴别中仅对盐酸麻黄碱进行了考察；《中国药典》2015年版(一部)麻黄含量测定采用了专用色谱柱-极性乙醚联合苯基键和硅胶柱[7]，该色谱柱并不普遍且价格较高，在实际工作中获取和使用受到限制。本研究采用C18色谱柱建立肺炎合剂中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量测定方法，考察了不同有机相、不同流速、不同缓冲液体系[8-14]、不同比例等，分离效果均欠佳。经反复优化，最终确定的流动相体系为甲醇-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(梯度)，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱峰型较佳、分离度较好、杂质不干扰测定。本研究采用TLC法对君药麻黄中盐酸麻黄碱进行了鉴别，选用HPLC对君药麻黄中主要活性成分盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱进行了含量测定，初步建立了肺炎合剂的定性定量的方法，对制剂工艺的稳定性以及质量控制提供了理论依据。