HPLC-DAD-ELSD法同时测定22个产地通关藤中3种皂苷

李思雨，张冬月，韩 丽，张 慧

（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600）

通关藤为萝藦科牛奶菜属植物通关藤Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn.的干燥藤茎，最早记载于 《滇南本草》，主产于云南、贵州、广西等地，其味苦，性微寒，具有抗肿瘤、清热解毒等作用，由通关藤为原料制成的消癌平制剂临床应用广泛［1-3］，用于治疗胃癌、食管癌、肝癌等消化道肿瘤［4］，主要药效物质是C21甾体皂苷类化合物［5］。目前，有关通关藤及其制剂的含有量测定方法大多以2015年版 《中国药典》 收载的HPLC-ELSD 法测定通关藤H 为主，而且也有报道采用HPLC 法同时测定通关藤苷 G、I［6］，或通关藤苷 A、D 含有量［7］，UPLC-MS／MS 法测定通关藤苷 A、H、I 含有量［8］，HPLC-ELSD 法测定通关藤皂苷 L、M、N、O、P 含有量［9］，HPLC-UV 法测定通关藤苷 A 含有量［10］，比色法测定总皂苷含有量［11-14］等，但尚无HPLC-DAD-ELSD 联用方法同时测定具有紫外吸收的通关藤苷G、I 及无紫外吸收的通关藤H 含有量。为了开发抗肿瘤新药原料，并更好控制其提取物质量，本实验建立HPLC-DAD-ELSD 法同时测定22 个产地通关藤中通关藤苷G、H、I 的含有量，为相关新药开发奠定基础，也为临床用药提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪（配置真空脱气机、四元泵及 DAD、ELSD 检测器）；KQ-250DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；JP60-4 型电子分析天平（沈阳市龙腾电子有限公司）；CP225D 型电子分析天平（十万分之一，德国 Sartorius 公司）；RE-52A 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药 通关藤苷H（批号111913-201202）对照品购自中国食品药品检定研究院；通关藤苷 G（批号PM0529SA13）、通关藤苷 I（批号 PM0529SB13）对照品均购自上海源叶生物科技有限公司。甲醇为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙腈为色谱纯（天津星马克科技发展有限公司）；水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.3 药材 22 个产地通关藤均为实地采集，经辽宁中医药大学药学院张慧教授鉴定为萝藦科牛奶菜属植物通关藤Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn.的干燥藤茎。药材经70%乙醇提取后，浓缩干燥。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-水（45 ∶55）；体积流量1.0 mL／min；柱温 30 ℃；检测波长235 nm；进样量20 μL。ELSD 参数为漂移管温度80 ℃；载气压力3.5 bar（1 bar=100 kPa）；增益值 5。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取通关藤苷G、H、I 对照品适量，置于同一量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，即得（三者质量浓度分别为 0.841、1.921、1.513 mg／mL）。

2.2.2 供试品溶液制备 将提取物置于量瓶中，70%乙醇稀释至 0.15 g／mL，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 取70%乙醇，按 “2.2.1”项下方法制备供试品溶液，即得。

2.3 专属性试验 精密吸取供试品、对照品、阴性对照溶液各20 μL，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，见图1。可知，阴性对照溶液色谱图中未见与对照品溶液中3种成分保留时间相同的色谱峰，表明阴性无干扰，方法专属性良好。

图1 各成分HPLC-DAD-ELSD 色谱图

2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液 0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL，置于 5 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，在 “2.1”项色谱条件下进样测定。其中，通关藤苷G、I（DAD）以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归；通关藤苷H（ELSD）以进样量的自然对数为横坐标（X），峰面积的自然对数为纵坐标（Y）进行回归。结果，通关藤苷 G、H、I 方程分别为Y= 1 092X-317.76（r=0.999 2）、Y=1.139 5X＋4.471（r=0.999 0）、Y=472.89X-651.48（r=0.999 1），分别在 1.768～5.305、3.842～11.526、3.026～9.078 μg 范 围 内呈良 好 的 线 性关系。

2.5 精密度试验 精密量取对照品溶液20 μL，在 “2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得通关藤苷G、H、I 峰面积RSD 分别为0.94%、1.96%、1.01%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 精密称取云南产药材粉末6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，测得通关藤苷 G、H、I 含有量 RSD 分别为1.54%、1.90%、1.03%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 精密量取供试品溶液 20 μL，于 0、2、4、6、8 h 在 “2.1”项色谱条件下进样测定，测得通关藤苷 G、H、I 峰面积 RSD 分别为 0.94%、1.91%、1.80%，表明供试品溶液在8 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 精密加入通关藤苷G 对照品溶液（0.841 mg／mL）2.0 mL、通关藤苷H对照品溶液（0.102 4 mg／mL）3.0 mL、通关藤苷 I 对照品溶液（1.513 mg／mL）2.5 mL，置于同一量瓶中，平行 6 批，挥干溶剂，加入各成分含有量已知的提取物，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表1。

2.9 样品含有量测定 分别取22 个产地提取物，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在 “2.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果

3 讨论

3.1 指标成分选择 2015年版 《中国药典》 一部中，通关藤含有量测定成分仅选择通关藤苷H，难以准确反映其药效。课题组前期药效学实验发现，通关藤苷 G、H、I 具有明显抗肿瘤作用，故本实验选择三者作为指标成分。

3.2 色谱条件选择 本实验曾采用 40 ∶60、47 ∶53、50 ∶50等比例的乙腈-水流动相，发现在45 ∶55 时通关藤苷G、H、I 分离效果最好，峰形最佳。由于通关藤苷 G、I 有紫外吸收，而通关藤苷 H 无紫外吸收，故本实验采用HPLC-DAD-ELSD 法，并且发现该方法灵敏度高，重复性好。

3.3 含有量分析 除广西、四川2 个批次外，其他20 个产地通关藤70% 乙醇提取物中通关藤苷H 含有量均符合2015年版 《中国药典》 不得低于0.12%的规定；不同产地提取物中通关藤苷G、H、I 含有量差异明显，其中通关藤苷H 可达33 倍，并且通关藤苷I 普遍高于其他2种成分，表明多成分同时测定可更全面科学地评价该药材质量。