高原型青海藏羊超数排卵效果分析

文│隋鹤鸣 孟飞 许海涛 朱芳贤（全国畜牧总站）

莫延新 谢秀梅（青海省家畜改良中心）

高原型青海藏羊是经过青藏高原牧民长期选育的特色地方品种山羊。此品种适应性强、抗病力强、耐粗饲而且肉质优良，是当地肉类主要来源。为了避免在未来发展过程中，出现杂交、近交、环境变化等造成的优良基因流失问题，开展了青海良种高原型青海藏羊保种胚胎收集保存工作。冷冻胚胎保存可以保存品种个体的全部基因。胚胎细胞可以长期存活于超低温条件，可以通过胚胎移植和核移植技术恢复遗传资源，因此，在保护动物遗传资源，尤其是挽救濒危动物方面，冷冻胚胎技术发挥了重要的作用。

一、材料与方法

1.供体羊。从主产区挑选纯种12～36月龄高原型青海藏羊在青海省家畜改良中心西宁示范基地开展。

2.主要药品与器械。日本（JP）FSH（促卵泡素），10AU×5支；加拿大（CAN）Follitropin FSH，每支400毫克；氯前列烯醇（PG），每支0.2毫克/2毫升；促黄体素释放激素A3（促排3号），20微克×10支；普鲁卡因每支40毫克/2毫升；黄体酮阴道缓释剂（CIDR），每支1.9克。

羊用二通式冲卵管、滞留针、集卵杯、手术器械、恒温水浴锅、体视显微镜、自制手术保定架。

3.供体超数排卵处理方案。供体超数排卵处理方案见表1，各试验组埋置CIDR和配种后各注射维生素ADE注射液3毫升和促排3号3/4支。

4.供体羊配种。观察到第1次发情12小时后配种，之后间隔10～12小时再配一次，连续配种2～3次。

5.胚胎的采集与质量鉴定。以发情日为第0天，第7天采用手术法回收胚胎。用含1%血清的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗两侧子宫角，每侧用液20毫升。子宫回流液静置3分钟，在显微镜下捡出卵子，并保存在保存液中。根据形态学标准进行胚胎分级，通常有用胚胎或可移胚胎包括A、B、C级胚胎，根据保种需要，本文中有效胚胎为A、B级胚胎。分级标准如下：

A级：胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液泡，变性细胞少于15%。

B级：轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见到少量附着的细胞和液泡，变性细胞少于50%。

C级：轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞少于75%。

D级：凡在16细胞以下的受精卵，或有碎片、轮廓不清晰、结构松散、变性细胞达75%以上都属于D级。

6.数据处理。采用SPSS 17.0软件试验数据进行统计分析，试验数据以“平均值±标准差”表示，采用单因素方差分析对各组数据进行差异显著性分析。超数排卵有效但冲卵失败的个体不计入数据分析。

二、结果与分析

1.高寒地区高原型青海藏羊超数排卵效果。超数排卵处理37只高原型青海藏羊，有效冲胚34只，结果表明为只均黄体数7.84个，只均获有效胚3.43 枚。

2.日本FSH不同剂量超数排卵效果的比较。日本FSH不同剂量超数排卵效果见表2，日本FSH不同注射量中Ⅱ组（20.0AU）效果最佳，只均黄体数、只均回收卵数、卵子回收率、只均有效胚数、有效胚率（有效胚占回收卵的比例）、受精率分别为5.94个、4.06个、68%、2.33枚、57%和85%。Ⅰ组只均黄体数、只均回收卵数、卵子回收率、只均有效胚数、有效胚率高于Ⅱ组（P＞0.05），但由于其参试供体少，我们认为效果总体评价不如Ⅱ组。Ⅲ组只均黄体数、只均回收卵数、卵子回收率高于Ⅱ组（P＞0.05），但只均有效胚数、有效胚率低于Ⅱ组（P＜0.05），受精率也低于Ⅱ组（P＞0.05）。

表1 超数排卵处理方案

3.加拿大FSH不同剂量超数排卵效果的比较。加拿大FSH不同剂量超数排卵效果见表3，加拿大FSH不同注射量中Ⅱ组（240毫克）效果最佳，只均黄体数、只均回收卵数、卵子回收率、只均有效胚数、有效胚率、受精率分别为10.33个、8.33个、81%、5.67枚、68%和79%。Ⅰ组卵子回收率、有效胚率、受精率高于Ⅱ组（P＞0.05），但只均黄体数、只均回收卵数、只均有效胚数低于Ⅱ组（P＞0.05），我们认为效果总体评价不如Ⅱ组。Ⅲ组只均黄体数高于Ⅱ组（P＞0.05），但只均回收卵数、卵子回收率、只均有效胚数、有效胚率低于Ⅱ组（P＞0.05），受精率显著低于Ⅱ组（P＜0.05）。

4.不同品牌F S H超数排卵效果的比较。不同品牌F S H超数排卵效果见表4，比较了效果最佳的日本FSH20.0AU组与加拿大FSH240毫克组，加拿大FSH只均黄体数、只均回收卵数、卵子回收率、只均有效胚数、有效胚率都显著高于日本FSH（P＜0.05），只有受精率低于日本产FSH（P＞0.05），此次试验中加拿大FSH效果优于日本FSH。

表2 日本FSH不同剂量超数排卵效果的比较

三、讨论

1.高寒地区高原型青海藏羊超数排卵效果分析。超数排卵对于供体来说是一个复杂的生理过程，超数排卵处理方法要根据供体本身激素水平的变化而设计，但因不同品种、不同个体、不同药品和不同生长环境，其处理方法也不相同，超数排卵结果也不一样。朱士恩总结了我国2010年以前绵羊超数排卵结果发现，美利奴超细毛羊超数排卵获得可移植胚胎数量平均为5.83～6.56枚/次，肉用绵羊为6.98～9.77枚/次。但有关地方品种绵羊超数排卵的报道少，尤其是高海拔、高寒地区。

由于生态环境和品种的差异，超数排卵结果差异也很大，朱芳贤等（2014）报道兰州大尾羊获得A级胚胎平均为5.0枚/次。此次试验只均黄体数只有7.84个，只均获有效胚只有3.43枚，可能原因，一是高寒地区藏羊繁殖率低，母羊一般年产一胎，一胎一羔，产双羔者很少。二是此实验供体羊都是放牧，超数排卵处理过程中应激大，影响超排效果，最明显的影响是试情时躲闪，无法判断准确发情时间。配种时不稳，精液不到生殖道或到的少。三是供体羊有的剽悍，采食过多，群体中肥瘦分化大。建议驯养一段时间后开展超数排卵工作，同时注意分群饲养。

2.FSH不同剂量超数排卵效果的比较。适宜的FSH剂量是取得好的超数排卵效果的关键因素之一。较大的剂量造成较强的激素应答反应，刘广振认为较强的激素应答反应使得部分个体优势卵泡排卵过早，黄体功能不全，分泌孕酮水平较低，从而造成胚胎退化。谭景和等、范必勤等也认为较强的激素应答反应使得卵巢过度增大，卵泡过度增多，可能卵母细胞质量下降，排卵后卵子未进入输卵管中而直接掉入腹腔，最终卵子回收率低，未受精卵多，可用胚率也很低，A、B级胚胎更少。本次试验中日本FSH大剂量24.0AU组、加拿大FSH剂量280毫克组都是卵泡发育多，但回收到的卵子少，尤其是有效胚胎少，可能卵子质量差，造成受精率低和胚胎退化的多。本次试验证实了以上说法，同时也说明，高原型青海藏羊适宜FSH剂量为20.0AU的日本FSH和240毫克的加拿大FSH。

3.不同品牌FSH超数排卵效果的比较。超数排卵是应用不同品牌、不同批次的激素也是影响超数排卵效果的主要因素之一。桑润滋等认为，不同品牌、不同批次的激素是存在质量差异和效价不稳定等因素，纯度及所含促黄体素（LH）活性成分的多少，以及用于不同品种、不同个体超数排卵效果也不相同。本次试验中加拿大FSH超数排卵效果优于日本产FSH，说明加拿大FSH更适合高原型青海藏羊，但造成这样的原因可能是不在同一期进行，受营养等因素影响，建议大规模进行超数排卵前有必要做些预试验。

四、小结

本试验超数排卵处理37只高原型青海藏羊，结果表明：只均黄体数7.84个，只均获有效胚3.43枚，同时也表明，日本FSH的适宜剂量为20.0AU，只均黄体数5.94个，只均获有效胚2.33枚；加拿大FSH的适宜剂量为240毫克，只均黄体数10.33个，只均获有效胚5.67枚；加拿大产FSH效果优于日本产FSH，差异显著，说明加拿大FSH更适合高原型青海藏羊，同时建议大规模进行超数排卵前有必要做些预试验。

表3 加拿大产FSH不同剂量超数排卵效果的比较

表4 不同品牌FSH超数排卵效果的比较