槲皮素治疗高尿酸血症的机制研究

陈海青 周 璇 王秀秀

高尿酸血症是由于人体内尿酸的合成增加或排出减少等原因引起的一种代谢性疾病，最主要的危害是引起痛风。越来越多的研究表明高尿酸血症与痛风、高血压、慢性肾脏病、肥胖、糖尿病、脑卒中等代谢性疾病密切相关。随着人们生活习惯的改变，我国高尿酸血症逐年上升，特别是在沿海地区，严重影响人们的生活质量。目前降尿酸的药物主要有黄嘌呤氧化酶抑制剂、尿酸转运体抑制剂和重组尿酸酶补充剂等，例如秋水仙碱、糖皮质激素和别嘌醇等，但对肝肾毒性较大。随着中药的发展，利用中药治疗高尿酸血症的研究越来越来多，中药越来越成为疗效确切、安全性高的降尿酸药物[1,2]。

槲皮素是一类黄酮类化合物，广泛存在于各种植物性食物中，具有抗氧化、抗炎等生物活性。已有大量研究表明槲皮素具有降尿酸、治疗痛风性关节炎的作用[3]。但对于槲皮素降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的机制探究少有报道。本研究旨在通过采用尿酸酶敲除建立稳定的小鼠高尿酸血症模型，研究槲皮素降低血清尿酸水平的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物尿酸酶基因敲除小鼠，雄性，体质量(24±2)g;购自南方动物模式中心。以正常野生型大小一致的雄性小鼠为对照。分笼饲养，保持室温25 ℃，通风良好，自然光照，正常饮食饮水。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

1.1.2 药品与试剂槲皮素(上海将来实业有限公司，纯度98%，批号:A007353-50 g)。Trizol(Thermo Scientific 公司)；PMSF(Sigma-Aldrich 公司)；蛋白裂解液(碧云天)；BCA 蛋白定量试剂盒(Thermo Scientific 公司)；GLUT9、ABCG2、URAT1抗体购置abcam公司。引物均有生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及取材将SPF级雄性小鼠分为野生型对照组(wt)、高尿酸模型组(HUA)，及槲皮素低、中、高剂量组(100、200、400 mg /kg)组，每组8只。鉴定出高尿酸血症小鼠纯合子第5周起，给小鼠灌胃对应质量浓度槲皮素溶液，每日1 次，连续2周。灌胃2周后，内眦取血。颈椎脱位处死小鼠;取肾脏及回肠、空肠放于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 血清生化指标检测取血于3500 r·min-1离心10 min，分离血清，全自动生化分析仪测定尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、总胆固醇(TC)、血糖(Glu)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的浓度。取出肝脏组织加组织裂解液制备成肝组织匀浆液，高速离心，取上清液用BCA法测定蛋白浓度。

1.2.3 RT-qPCR检测肾脏、回肠、空肠中尿酸转运体GLUT9、ABCG2、URAT1的表达。利用Trizol提取肾脏、回肠和空肠中总RNA放于紫外分光度计上检测 RNA 的浓度。按照逆转录试剂盒说明建立 20 μl 反应体系：6 μl DEPC 水，0.5 μl RNA 酶抑制剂，2 μl 随机引物，2 μl总RNA，将20 μl反应溶液放于37 ℃水浴锅中保温60 min合成cDNA。利用 SYBR Green 染料，采用两步法设置程序：95 ℃、5 min，预变性；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40 个循环；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，置于ABl7500 PCR仪进行实时荧光定量PCR，检测肾脏、回肠、空肠中尿酸转运体mRNA的表达情况。利用 Primer Priemer 5.0 软件设计引物。引物如下：URAT1:F 5’-ATGGCTGGGTTTACGACCAC-’3,R 5’- GCCCAAACCTATCTGAGGCA-’3；GLUT9：F 5’-CTTCCTGTGGACTCTGCCTC-’3,R5’-GACGAGCGAGAAGGACCATT-’3；ABCG2：F 5’-TCTCAACTCCACTGCAAGC-’3,R 5’-ACGTGGTCATTACTGGAAGACA-’3；OAT1：F 5’-GCAGCCTATGCACCCAACTA-’3，R5’-AACTGGCCCAAGCTGTAGAC-’3；OAT2：F 5’-ACCCTGGTTGGGTACCTGAT-’3，R5’-AGAAGCCATCGTGCAGACTC-’3；OAT2：F 5’-TAAAACAACCCTTTGGCGGC-’3，R5’- GAGCTGGATTCAGTTGGGCT-’3。结果分析：采用ΔΔCt法分析每个基因的Ct值，以内参 GAPDH为对照值，进行标准化计算后得出结果，与对照组比较，进行统计学分析。

1.2.4 蛋白印记检测肾脏、肠道中尿酸转运体ABCG2表达将组织切成小块，按每 100 mg 组织加入 1 ml含1% PMSF的RIPA裂解液冰上研磨匀浆，14000 rpm离心15 min，取上清，BCA 法测定蛋白含量。按1∶4比例加上蛋白上样缓冲液，金属浴加热煮沸 10 min后进行SDS-PAGE电泳，转膜，将胶上蛋白转至 PVDF 膜。将转有蛋白的PVDF 膜在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h,孵育兔抗ABCG2、GLUT9和UART1一抗2 h，在辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗反应液37 ℃孵育1 h，ECL 显色后采用凝胶成像系统拍照，通过 Image.Pro Plus 软件分析与内参条带的灰度值比值，比较各组差异。

1.2.5 ELISA试剂盒测定肝脏中黄嘌呤氧化酶活性取肝脏组织，按每100 mg组织加入1 ml含1% PMSF的RIPA裂解液，冰上研磨匀浆，14000 rpm离心15 min，取上清，加到96孔板中，在相同缓冲液中加入18 μl 15 μm黄嘌呤引发反应，在加入底物缓冲液后，立即测量37 ℃反应30 min在295 nm的吸光度。基于尿酸标准曲线，从吸光度增加30 min计算尿酸产量。用BCA蛋白质测定试剂盒测定肝匀浆中的蛋白质浓度。XO活性表示为每分钟每毫克蛋白质产生的尿酸含量。

2 结果

2.1 槲皮素对高尿酸血症小鼠血清生化指标影响与正常组相比，高尿酸血症组血清UA、Cr、BUN显著升高(P<0.05)，这表明高尿酸血症模型造模成功。此外，高尿酸血症小鼠LDL含量也升高，但甘油三酯和葡萄糖含量没有明显变化。与高尿酸血症小鼠相比，400 mg/kg体质量的槲皮素注射显著抑制血清UA浓度，血清肌酐与尿素氮水平也降低，并且呈剂量依赖性。但不同浓度的槲皮素对甘油三酯和葡萄糖水平影响不明显。见图1。

注：矩形条及其误差条分别代表平均值和标准偏差(n=6)。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与高尿酸血症组相比，#P<0.05，## P<0.01图1 槲皮素对高尿酸血症小鼠血清生化指标影响

2.2 槲皮素对高尿酸血症小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响我们进一步检测了肾脏黄嘌呤氧化酶活性变化，黄嘌呤氧化酶在UA合成中起重要作用。与正常对照相比，高尿酸血症肝脏黄嘌呤氧化酶活性显著升高(P<0.05)。与高尿酸血症模型组相比，高浓度槲皮素显著降低了黄嘌呤氧化酶的活性，但低浓度和中浓度的槲皮素对黄嘌呤氧化酶活性无显著影响。见图2。

2.3 槲皮素对小鼠肾脏尿酸转运体mRNA的影响与对照组比较，模型组小鼠肾脏GLUT9和 URAT1 mRNA显著升高(P<0.01)，而转运体ABCG2 mRNA显著降低，OAT1、OAT2和OAT3无显著变化。与模型组比较，槲皮素高、中剂量可恢复高尿酸血症小鼠肾脏降低的ABCG2 mRNA(P<0.01)，降低GLUT9mRNA 表达，对URAT1、OAT1、OAT2和OAT3mRNA的表达无明显影响。见图3。

注：矩形条及其误差条分别代表平均值和标准偏差(n=6)。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与高尿酸血症组相比，#P<0.05，##P<0.01图2 槲皮素对高尿酸血症小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响

注：矩形条及其误差条分别代表平均值和标准偏差(n=6)。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与高尿酸血症组相比，#P<0.05，##P <0.01图3 槲皮素对高尿酸血症小鼠肾脏尿酸转运体mRNA表达的影响

2.4 槲皮素对小鼠小鼠肾脏尿酸转运蛋白GLUT9、URAT1和ABCG2表达水平的影响通过蛋白印记，我们进一步检测了槲皮素对小鼠肾脏尿酸转运蛋白GLUT9、URAT1和ABCG2表达水平的影响。结果显示，与模型组对比，高浓度的槲皮素显著降低了GLUT9和URAT1的表达，低、中浓度对GLUT9和URAT1的表达无显著影响。中、高浓度的槲皮素显著增加了ABCG2的表达。见图4。

注：矩形条及其误差条分别代表平均值和标准偏差(n=6)。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与高尿酸血症组相比，#P<0.05，## P<0.01图4 槲皮素对小鼠小鼠肾脏尿酸转运蛋白GLUT9、URAT1和ABCG2表达水平的影响

2.5 槲皮素对小鼠肠道转运体GLUT9、URAT1和ABCG2 mRNA表达的影响与对照组相比，高尿酸模型组肠道转运体ABCG2表达明显下降，GLUT9升高，URAT1无明显变化。而与高尿酸血症模型组相比，槲皮素高剂量组显著提高了ABCG2 表达水平，降低了GLUT9的表达，而对URAT1无明显影响。见图5。

注：矩形条及其误差条分别代表平均值和标准偏差(n=6)。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与高尿酸血症组相比，#P<0.05，##P<0.01图5 槲皮素对小鼠肠道转运体GLUT9、URAT1和ABCG2 mRNA表达的影响

3 讨论

高尿酸血症是人类最常见的代谢紊乱病之一，最常见的是导致痛风性关节炎和尿酸肾结石。高尿酸血症也与高血压和高脂血症、糖尿病和肥胖的发展有关。尿酸水平是预防痛风和其他疾病的关键因素。在过去的几年中，大量学者对黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇降尿酸作用越来越感兴趣。然而别嘌呤醇具有诱发过敏综合征，Stevens-Johnson综合征、肾毒性等不良作用。一些植物化学物质如黄酮类化合物因其具有天然的黄嘌呤氧化酶抑制特性，并对高尿酸血症一些并发症具有的保护作用而受到重视[4]。槲皮素是水果和蔬菜中的主要黄酮醇，在苹果、葡萄、浆果、红洋葱、西兰花等植物中含量丰富。作为有效的抗氧化剂，槲皮素的生物活性包括抗癌剂、抗炎性和预防视网膜变性等已被大量研究。尽管大量研究表明槲皮素通过抑制黄嘌呤氧化酶活性降低血尿酸作用[5]，但机制仍不清楚，特别是槲皮素对尿酸转运体的研究少有报道。本实验通过基因敲除建立高尿酸模型小鼠，发现槲皮素能降低血尿酸水平，其机制可能通过调节肾脏、肠道中尿酸转运体ABCG2和GLUT9来降尿酸的。

尿酸酶(Uox)是尿酸分解的关键酶，尿酸酶敲除会导致尿酸分解异常，进而导致高尿酸。我们利用CRISPR/Cas9技术，获得Uox基因敲除的杂合子小鼠，通过杂合子交配，获得Uox基因敲除纯合子小鼠。我们的结果表明这种基因敲除的小鼠尿酸明显高于正常组。相对于其他建模方法如抑制尿酸转运体功能、增加尿酸前体物质摄入、抑制尿酸酶功能等，基因敲除建模更加稳定，也更有利于研究药物对尿酸排泄的作用机制。给小鼠定期注射槲皮素2周后，能显著降低血清尿酸水平，并且与槲皮素呈剂量依赖型。此外，高剂量槲皮素也能显著降低尿酸氮、肌酐的含量，对肾脏起到保护作用。之前很多研究也表明槲皮素能降尿酸，和我们的研究一致[6]。

高尿酸血症90%以上是因尿酸排泄减少所致，肾脏为尿酸排泄的主要器官，由位于肾小管上皮细胞的尿酸转运蛋白共同协调完成。按照功能不同可分为重吸收相关蛋白、排泄相关蛋白和骨架蛋白。这些尿酸转运蛋白是高尿酸血症和其他代谢紊乱的纽带，也是新型降尿酸药物的研究靶点[7]。其中重吸收和排泄相关蛋白一直是研究的热点，在治疗高尿酸血症中起着重要的作用。肾脏中的尿酸处理非常复杂，涉及肾小球滤过，肾小管重吸收和分泌。位于近端肾小管细胞顶端和基底外侧膜的尿酸转运蛋白URATI和GLUT9分别参与肾脏对尿酸的重吸收。大量研究表明URAT1、GLUT9L基因敲除小鼠的尿酸排泄显著增加[8～12]。我们研究中发现，高剂量槲皮素能显著降低GLUT9的表达，而对URAT1转录没有明显影响。有机阴离子转运蛋白包括OAT1、OAT2和OAT3虽然也对尿酸盐的摄取有关[13～15]，但在我们的研究中发现，与对照组相比，高尿酸血症小鼠组及槲皮素处理组对OAT1、OAT2和OAT3没有明显影响。而在肾脏中尿酸排泄相关蛋白ATP 结合盒蛋白家族G 蛋白亚家族成员2(ABCG2)明显受槲皮素的影响，并且呈剂量依赖性，这在蛋白和mRNA水平上都得到验证。ABCG2在肾脏和肠道中均大量表达，位于上皮细胞的管腔侧膜，与尿酸排泄具有重要的关系[16]。ABCG2表达降低不仅会影响肾脏排泄尿酸的能力，还会降低肠道尿酸排泄，继而加重肾脏的尿酸负荷，导致肾脏损伤。以ABCG2为药物靶点的药物越来越受到重视，提高ABCG2在肠道的表达，可减轻肾脏排尿酸负荷，避免肾小管功能受损。小肠是许多类黄酮糖苷的主要吸收位点，可以在肠的不同部位被吸收。我们的研究表明槲皮素不仅可以影响肾脏中的转运体的表达，还可以降低肠道中GLUT9表达，增加ABCG2的表达，增加尿酸的排泄，起到双向降尿酸的作用。

总之，槲皮素可明显降低高尿酸血症大鼠血清尿酸水平，其降尿酸机制是通过降低肾脏和肠道尿酸转运体GLUT9，增加ABCG2表达实现。

(本文校对：周金荣 收稿日期2019-01-25)