肉苁蓉多糖闪式提取工艺及其抗糖基化分析

张喜峰，邓猛猛，罗光宏，杨生辉，王丹霞

(1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2.甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖 734000；3.河西学院甘肃省微藻工程技术研究中心，甘肃 张掖 734000)

非酶糖基化是指蛋白质或氨基酸中游离氨基与还原糖的醛基之间发生一系列重排、脱水、氧化、缩合等反应 (又称 Maillard反应)，从而形成具有活性的晚期糖基化终产物(AGEs)[1]，其与机体氧化应激有关，可引发糖尿病、肾脏疾病、阿尔茨海默病(AD)等慢性疾病[2-3].

肉苁蓉(Cistanchedeserticola)为列当科肉苁蓉属多年生植物，寄生在梭梭类植物根部，在中国主要产于新疆、内蒙古、甘肃和宁夏等地，素有“沙漠人参”之美誉[4].肉苁蓉长期以来被用作治疗肾虚阳痿、老年便秘、腰膝酸痛、血虚症等[5].药理研究表明，肉苁蓉具有抗炎活性[6-7]、抗骨质疏松[8]、镇静[9]、抗疲劳等活性[10-11].多糖为肉苁蓉主要有效成分之一，具有降血糖、降血脂作用[12]和对淋巴细胞的免疫活性[13]等功效.

闪式提取法作为一种新型提取方法，是利用一定量溶剂在闪式容器中将物料高速搅拌，从而达到物料组织细胞壁快速破碎，有效成分释放进入提取液，该方法可在短时间内完成，具有显著减低能耗，节约成本的作用[14-15].卫强等[16]比较了4种提取多糖方法，闪式提取具有较佳的提取效果；李明华等[17]优化了金针菇多糖闪式提取工艺，与高温浸提相比，其提取率提高了40.08%；程振玉等[18]研究表明，闪式法对北五味子多糖提取率高于回流法和微波辅助法，且耗费时间短，溶剂用量少.但目前为止，有关肉苁蓉多糖的提取主要采用表面活性剂辅助提取法[19]、热水浸提法[20]、循环超声提取法[21]等传统方法，采用闪式提取的相关研究还未见报道.

因此，基于肉苁蓉多糖优越的功能特性，本研究以肉苁蓉为材料，采用响应面试验优化闪式提取肉苁蓉多糖的条件，初步探讨其多糖对糖基化产物的抑制效果，以期能为肉苁蓉多糖资源的开发和利用提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

肉苁蓉：购于张掖市甘州区德生堂药店，经罗光宏教授鉴定为列当科肉苁蓉属多年生植物，干燥粉碎后密封保存；无水乙醇、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、赖氨酸均为分析纯.

DD-5M低速大容量离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；722S可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司制造；梅特勒电子天平ME54E，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；LS55型荧光光度计，PE公司； JHBE-50T(实验型)闪式提取器，河南智晶生物科技股份有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 肉苁蓉多糖提取液的制备 准确称取一定量粉碎后肉苁蓉粉末，按照一定料液比加入蒸馏水，转移至闪式提取器中，在一定提取转速下提取一定时间后，4 000 r/min离心10 min，将上清液定容至100 mL，混匀后，待用.

1.2.2 标准曲线的制备及肉苁蓉中多糖含量的计算 参照文献[11]的方法，略作修改.准确吸取浓度为100 μg/mL的葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于具塞试管中，加入质量分数为6%苯酚1 mL，再加入5 mL浓硫酸，加水补足至8 mL，混匀，在490 nm处测定吸光度，以浓度C为横坐标，吸光值为纵坐标进行线性回归分析.得到标准曲线方程C=12.402x-0.009 1，R2=0.997 6.

精密吸取1.2.1制备的多糖提液0.2 mL置于具塞试管中，依次加入6%苯酚1 mL和浓硫酸5 mL，加水补足至8 mL，充分摇匀后，放置冷却至室温，以不加提取液的混合试剂为空白对照，在490 nm处测定吸光值，计算多糖得率.

(1)

式中，C为提取液中多糖质量浓度(mg/mL)；V为提取液的体积(mL)；M为肉苁蓉样品质量(g).

1.2.3 闪式提取肉苁蓉多糖单因素试验设计 参照文献[22]的方法，略作改动.在提取转速为6 000 r/min，提取时间为60 s，料液比为1∶50 g/mL的条件下，固定其他条件不变，设置料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL；提取时间40、50、60、70、80 s，提取转速2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 r/min，以多糖提取得率为指标，进行单因素试验，每个试验重复3次.

1.2.4 响应面优化试验设计 在单因素试验基础上，对料液比(A)、提取转速(B)、提取时间(C)为自变量，多糖得率为因变量，利用Design-expert 8.0.6.0软件进行响应面优化试验设计，见表1.

1.2.5 肉苁蓉多糖抗糖基化活性的测定 参照文献[23]的方法，采用赖氨酸/葡萄糖模拟体系评价非酶反应过程中AGEs形成情况，取浓度为0.2 mol/L的赖氨酸溶液和葡萄糖溶液各1mL，加入1 mL多糖溶液(0.1～0.5 mg/mL)充分混匀，在温度为37 ℃密封孵育10 d，在λex/λem=370 nm/440 nm测定不同浓度下的荧光值，采用同浓度的氨基胍(AG)作为阳性对照.以不添加多糖但水浴10 d的模拟体系为对照组；以不添加多糖也不水浴的赖氨酸/葡萄糖模拟体系为空白组.按以下公式计算肉苁蓉多糖对赖氨酸/葡萄糖模拟体系AGEs相对抑制率.

表1 试验因素及水平

式中，F样品为加入多糖提取液且水浴的反应液的荧光值；F对照为不添加多糖但水浴的赖氨酸/葡萄糖模拟体系的荧光值；F空白为不添加多糖也不水浴的赖氨酸/葡萄糖模拟体系的荧光值.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比的影响 由图1可知，当料液比在1∶20～1∶50范围内时，多糖得率呈现逐渐增加的趋势；当料液比为1∶50时，多糖得率达到最大值.原因可能是随着提取液体积逐渐增加，提取液中溶出多糖的浓度逐渐减小，形成了一定的浓度梯度[24].因此，多糖扩散速率快，得率高；当料液比超过1∶50后，多糖得率增加不显著，提取液体积增加导致热能消耗过多，且增加后序浓缩处理时的步骤.因此.确定料液比为1∶50.

2.1.2 提取转速的影响 由图2可知，随着提取转速逐渐增加，多糖得率呈现先增加后下降的趋势，当提取转速为6 000 r/min时，提取得率达到最大值.原因可能是随着闪式提取器中内刀转速提高，在内外刀之间产生巨大剪切力，外刀腔内产生负压.在此环境中，物料组织破碎，暴露出有效成分，且在高速碰撞作用下被提取溶剂包围、解离、溶解，达到浓度平衡的过程.当提取转速继续增大时，引起刀头产热过多，影响提取得率.因此，提取转速确定为6 000 r/min.

图1 料液比对肉苁蓉多糖提取得率的影响Figure 1 Effect of solid to liquid ratio on the yield of CDPs

图2 提取转速对肉苁蓉多糖提取得率的影响Figure2 Effect of extraction speed on the yield of CDPs

2.1.3 提取时间的影响 由图3可知，在提取时间为40～60 s范围内，多糖得率呈现逐渐增大的趋势；当提取时间为60 s时，多糖得率达到最大值；继续增加提取时间，多糖得率逐渐下降.这主要是由于提取时间较少时，多糖未全部溶解于提取液中，随着时间延长，物料受到闪式提取器内外刀剪切、碰撞作用，促进多糖得率提高；当提取时间达到一定值后，由于剧烈碰撞导致温度升高，可能使多糖结构遭受一定程度破坏.因此，提取时间选择以60 s为宜.

2.2 响应面试验优化结果及分析

2.2.1 模型拟合及数据分析 在单因素基础上，采用Box-Behnken响应面设计对影响多糖得率的因素进行试验设计，结果见表2.

图3 提取时间对闪式提取肉苁蓉多糖的影响Figure 3 Effect of extraction time on the flash extraction of CDPs

响应面试验设计及方差分析见表2～3.三因素优化后二次回归方程为：多糖得率(%)=12.11+0.28A-0.77B+0.071C-1.02AB-0.025AC+0.52 BC-0.95A2-1.81B2-1.27C2

表2 Box-Behnken响应面设计及其结果

表3 响应面二次模型方差分析结果

2.2.2 响应面3D图分析 图4反映了提取参数二者间相互作用对肉苁蓉多糖得率的影响.如图4A所示，当提取时间(C)固定在零水平时，料液比(A)和提取转速(B)二者对肉苁蓉多糖得率具有二次效应；表明料液比和提取电压之间交互作用差异极显著，且与表3中的结果一致.当料液比和提取转速分别在1∶40～1∶50 (g/mL)和4 000～6 000 r/min范围内时，肉苁蓉多糖得率呈现逐渐增加的趋势.图4B、4C反映结果与图4A是类似的.

图4 肉苁蓉多糖得率的响应面3D图Figure 4 The effect of solid-liquid ratio(A),rotating speed(B),and extraction time(C) on the yield of polysaccharides ofCistanche deserticolaby 3D-response surface plots

2.2.3 最适条件的确定与验证 由软件分析可知，闪式提取肉苁蓉多糖最适条件为：料液比为1∶53.16 (g/mL)、提取转速为5 387.05 r/min、提取时间为59.63 s，多糖提取得率理论预测值为12.27%；在试验验证过程中，为了便于实际操作，最佳条件修正为：料液比为1∶53 (g/mL)、提取转速为5 387 r/min、提取时间为60 s，在此条件下重复3次试验，多糖提取平均得率为12.35%，与预测值较接近.说明此模型获得的优化条件可用于肉苁蓉多糖提取.

2.3 肉苁蓉多糖抗糖基化分析

由图5可知，随着多糖样品质量浓度逐渐增加，其对赖氨酸/葡萄糖模拟体系中AGEs抑制作用逐渐增加，在此范围内，体现二者间线性关系，且线性方程为：y=71.36x+18.744(R2=0.956 7)，其IC50为0.438 mg/mL；阳性对照氨基胍(AG)在此范围内线性方程为：y=93.04x+18.264(R2= 0.988 1)，其IC50为0.341 mg/mL.说明AG对糖基化抑制效果强于肉苁蓉多糖，可能是由于制备的多糖含有其他成分，有待于对其进一步分离纯化.

图5 肉苁蓉多糖和氨基胍(AG)抗糖基化作用Figure 5 Glycosylation effect of CDPS and aminoguanidine

3 讨论

本文采用闪式提取法制备肉苁蓉多糖，研究了料液比、提取转速、提取时间对其得率的影响，结果表明，在最佳提取条件下，多糖得率为12.35%；合适的料液比利于闪式提取器搅拌方便，过浓的比例会影响破碎效果；过长提取时间促使不稳定化学成分如蛋白质、果胶等杂质发生不可逆变性凝固，同时可能与部分有效成分结合形成沉淀，影响提取得率.肖道安[19]采用表面活性剂辅助提取肉苁蓉多糖，最优工艺条件下多糖得率为8.17%；热水浸提[20]和超声辅助[21]提取肉苁蓉多糖，其得率分别为6.72%和7.58%.闪式提取得率大约是表面活性剂辅助提取的1.5倍，热水浸提和超声辅助的1.83倍和1.63倍，提取时间明显缩短.因此，闪式提取肉苁蓉多糖比传统热水浸提、超声辅助和表面活性剂辅助提取得率要高.其机理可能为：依据内外刀产生的剪切作用和负压，使目标成分多糖在外力作用下被溶剂包围、解离、溶解，脱离后进入提取溶剂中，达到溶剂浓度平衡；闪式提取可能具有部分超声波振动作用，对目标成分在破碎物料内外的溶解平衡产生强力推动作用.

4 结论

本文采用响应面优化试验建立了闪式提取肉苁蓉多糖工艺的二次多项式数学模型，方差分析可知，其模型差异极显著，获得方程拟合程度好，对其得率影响的各个因素主次顺序为提取转速>料液比>提取时间，最优条件为料液比1∶53 (g/mL)、提取转速为5 387 r/min、提取时间60 s，在此条件下，多糖提取平均得率为12.35%.本研究制备的肉苁蓉多糖在一定浓度范围内对赖氨酸/葡萄糖模拟体系中AGEs具有一定的抑制效果，可为天然来源的AGEs抑制剂研究和开发提供参考依据.