昆虫病原线虫与吡虫啉混用对异迟眼蕈蚊幼虫的毒力测定
2019-06-01钱秀娟张文丽刘长仲
钱秀娟，张文丽，刘长仲
(1.甘肃农业大学植物保护学院,甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省玉门市饮马实业有限责任公司，甘肃 玉门 735218)
异迟眼蕈蚊(BradysiadifformisFrey)隶属双翅目(Diptera)长角亚目(Nematocera)眼蕈蚊科(Sciaridae)迟眼蕈蚊属(Bradysia)，是多种食用菌、观赏类植物等的主要害虫.主要危害虫态为幼虫，俗称根蛆，蛀食菌丝体和有机质，造成严重的经济损失[1].中国于2009年在云南首次记录，后期调查表明，异迟眼蕈蚊广泛分布在我国的食用菌温室大棚.本课题组于2012～2014年调查研究发现，异迟眼蕈蚊不仅是甘肃省食用菌产业的重要害虫，也严重危害韭菜、大葱等葱蒜类作物，是甘肃省部分韭菜种植区的优势种群，常与韭菜迟眼蕈蚊(BradysiaodoriphagaYang et Zhang)混合发生[2].
异迟眼蕈蚊危害韭菜时，主要以幼虫群集于韭菜根部，蛀食鳞茎和假茎，造成死苗，春秋季发生严重，多以幼虫在韭菜鳞茎或根茎及附近土壤中越冬，在保护地中，可周年发生[2].由于韭菜的连茬栽培以及温棚适宜的环境条件，根蛆对韭菜的危害逐年加重，危害面积达我国韭菜栽培面积的30%～80%，造成严重的经济损失.目前对异迟眼蕈蚊的防治仍以化学药剂防治为主，且因其于韭菜地下根茎内危害，化学杀虫剂控制效能会降低，个别菜农为追求防治效果，使用一些禁用类高毒农药，或施用浓度及用量超标等，导致韭菜农药残留超标，成为限制韭菜产业发展的主要因素[3].因此，对韭菜异迟眼蕈蚊的绿色防治技术研究已成为关注的焦点.
韭菜异迟眼蕈蚊的绿色防控技术包括高效低毒农药和生防因子、自然因子的利用.昆虫病原线虫(Entomopathogenic nematodes，EPNs)是一种可以工厂化生产的昆虫致病微生物，随食物或自然孔口、节间膜等侵入昆虫体内，并迅速释放其所携带的共生细菌，使寄主昆虫得败血症死亡.它们对植物、高等动物、蚯蚓及其他有益生物安全，寄生杀虫范围广、效果好、扩散能力强，施用以后可以自己寻找寄主，对栖境隐蔽、常规杀虫剂作用不到的地下害虫和钻蛀性害虫有特效[4].亦有许多研究表明，昆虫病原线虫与化学杀虫剂混用，对蛴螬等地下害虫有较高的控制效能[5-7]，因而，为了实现对地下害虫的高效、安全防控，将昆虫病原线虫低毒化学药剂混用来防治靶标昆虫是一种有效的策略[8].吡虫啉是烟碱类超高效杀虫剂，具有广谱、高效、低毒、低残留，害虫不易产生抗性，对人、畜、植物和天敌安全等特点[9]，并有触杀、胃毒和内吸等多重作用，目前在韭菜根蛆防治中广泛用以灌根[3].项目组研究发现(数据未发表)，吡虫啉对异迟眼蕈蚊具有较高的控制效能，且与昆虫病原线虫混用后，在吡虫啉剂量减半时，其控制效能远远大于其他农药处理及农药与昆虫病原线虫混用处理，因此，本试验拟对吡虫啉与昆虫病原线虫混用进行毒力测定.
昆虫病原线虫与低毒化学药剂混用不仅可以保证对非靶标生物以及环境的安全，降低昆虫病原线虫的施用成本，而且也可以提高对靶标昆虫的杀虫速度，在短时间内取得良好的防治效果，将有助于昆虫病原线虫大面积应用和推广.目前我国大力发展无公害蔬菜，农业部“双减”项目的推进，都是为了减少化学农药的用量[10-11]，因此，探讨昆虫病原线虫与低浓度化学药剂最佳的混配浓度，对于增强昆虫病原线虫对韭菜异迟眼蕈蚊的防治效果，降低农药使用量及韭菜异迟眼蕈蚊抗药性等均具重要意义，也可为昆虫病原线虫的田间应用和韭菜异迟眼蕈蚊的综合治理提供参考.
1 材料与方法
1.1 供试线虫及昆虫
供试线虫：斯氏线虫属Steinernemafeltiae0619HT，采用大蜡螟幼虫Galleriamellonella体内培养法，于4 ℃保存不超过15 d的新鲜侵染期线虫(IJs，infective juveniles).
供试昆虫：韭菜异迟眼蕈蚊3龄幼虫.采集于甘肃省甘谷县韭菜田，通过室内滤纸保湿培养法进行人工饲养，扩繁多代，并获得稳定种群后进行试验.
1.2 供试药剂
吡虫啉(imidacloprid)原药，化学名称：1-(6-氯吡啶-3-吡啶基甲基)-N-硝基亚咪唑烷-2-基胺，购于吉林八达农药公司.用二甲基亚砜配成母液，再用Tration X-100水溶液(0.1%)，稀释成不同梯度浓度溶液，待用.
1.3 试验方法
1.3.1 吡虫啉对韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的毒力测定 药膜法[7]：将吡虫啉母液分别稀释成1、5、8、10、25、50 mg/L，在9 cm培养皿底部放一张滤纸，滴加1 mL药液使其湿润.用大头针轻轻挑取10头3龄韭菜异迟眼蕈蚊幼虫于直径5 cm漏斗状的滤纸上，滴加1 mL药液使滤纸完全润湿并使韭菜异迟眼蕈蚊幼虫浸在药液中保持15 s再放入培养皿中，并加入5 mm长度的若干新鲜韭菜茎作为饲料，重复3次，以蒸馏水为对照.置于(25±1)℃的恒温培养箱内，保持黑暗处理48 h，检查记录各处理韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的死亡数，并计算其校正死亡率，用几率值法计算毒力回归方程，确定LC50等.
1.3.2 吡虫啉对昆虫病原线虫的毒性测定 浸渍法：将吡虫啉母液分别稀释成1、5、8、10、25、50 mg/L，用移液枪分别吸取10 mL放入直径9 cm的干净培养皿中，将昆虫病原线虫侵染期幼虫IJs放入浸渍，重复3次，以蒸馏水设置为对照.置于(25±1)℃的恒温培养箱内黑暗处理48 h.摇匀，随机吸取50头线虫在解剖镜下检查并记录死亡数，用几率值法计算毒力回归方程，确定LC50等.
判定昆虫病原线虫对药剂的反应标准[12]：死亡：身体僵直，不活动，对针刺无反应；亚致死：体躯卷曲，具痉挛或抽搐行为特征，对针刺无反应，或反应迟缓；无影响：与对照IJs无区别，体躯活动舒展，或静止不动，针刺反应迅速.
1.3.3 昆虫病原线虫与吡虫啉混配对韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的毒力测定 在培养皿底部9 cm的大滤纸上加1 mL浓度为吡虫啉对韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的1/4LC50、1/2LC50、3/4LC50的吡虫啉药液，使滤纸润湿；将线虫配制成1 000 IJs/mL的悬浮液，用1.3.2的方法取10头韭菜异迟眼蕈蚊幼虫于5 cm小滤纸上加1 mL线虫悬浮液和1 mL上述药液，再加入若干新鲜韭菜茎，盖上用蒸馏水喷洒润湿滤纸的培养皿盖子，重复3次，并用蒸馏水设空白对照.放在(25±1)℃的恒温培养箱内，保持黑暗处理48 h，检查并记录各处理的死亡数，计算校正死亡率并用几率值法计算毒力回归方程，确定LC50等.
1.3.4 吡虫啉对昆虫病原线虫的安全性评价 参考农业部农药登记环境试验，对天敌毒性试验的评价标准，以安全系数评价.于田间推荐浓度与5倍田间推荐浓度下，如处理组和对照组死亡率之间无显著差异，则认定其为对天敌低风险性农药.
安全系数(RQ)=药剂的LC50值/室内试验低浓度(即田间推荐剂量)
RQ≤0.05：极高风险性农药；0.05
1.4 数据处理
试验数据用SPSS 21.0和Excel 2016进行统计分析.
2 结果与分析
2.1 吡虫啉对韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的毒力测定
由试验结果(图1)可知，韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的死亡率与吡虫啉药剂浓度呈正相关(r=0.913)，随着吡虫啉药剂浓度的升高，韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的累计校正死亡率增大.在吡虫啉浓度为5 mg/L时，韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的死亡率仅为6.7%；吡虫啉浓度在5～25 mg/L时，韭菜异迟眼蕈蚊幼虫死亡率迅速增大，在25 mg/L时死亡率达73.3%；吡虫啉浓度为50 mg/L时，韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的死亡率达90%，均远远高于对照，且差异显著(P<0.05).说明吡虫啉对异迟眼蕈蚊幼虫具有较好的控制效能，且药剂浓度越高，其控制效能越好.
图1 吡虫啉对异迟眼蕈蚊的毒力测定Figure 1 Virulence of imidacloprid onBradysia difformisFrey
计算出毒力回归方程为y=3.457x+0.957,LC50=14.77 mg/L，相关系数r=0.913,95%置信区间2.240～4.674.根据毒力回归方程求得LC40=8.3 mg/L、LC30=7.5 mg/L、LC20=4.2 mg/L、LC10=2.2 mg/L且1/4LC50=4 mg/L、2/4LC50=8 mg/L、3/4LC50=10 mg/L.
2.2 吡虫啉对昆虫病原线虫的毒性测定
由试验结果(图2)可知，昆虫病原线虫的死亡率与吡虫啉药剂浓度呈正相关，随着药剂浓度的升高，昆虫病原线虫的死亡率增大.计算出毒力回归方程为y=0.787x+2.816,LC50=595.8 mg/L，相关系数r=0.921，95%置信区间为2.430～3.403.
吡虫啉对昆虫病原线虫的致死中浓度LC50=595.8 mg/L，而对韭菜异迟眼蕈蚊的致死中浓度LC50=14.77 mg/L，远远大于其靶标昆虫韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的.为了确定在低剂量下(韭菜异迟眼蕈蚊致死中浓度或田间推荐使用剂量)，吡虫啉对昆虫病原线虫的毒性及安全性，同时测定昆虫病原线虫对吡虫啉的耐药性.
2.3 昆虫病原线虫对吡虫啉耐药性及吡虫啉对线虫安全性评价
在田间推荐剂量浓度和5倍田间推荐剂量浓度及异迟眼蕈蚊(靶标昆虫)LC50的不同倍数条件下，吡虫啉对昆虫病原线虫的室内毒性不同(表1).在靶标昆虫的致死中浓度剂量LC5014.77 mg/L，及0.5倍田间推荐浓度(3.5LC50剂量)处理下，吡虫啉对昆虫病原线虫无毒性，与对照组差异不显著(P>0.05)，且两处理间差异极不显著(P>0.01)；其余各剂量下吡虫啉对昆虫病原线虫有毒性，且与对照组和0.5LC50剂量处理差异极显著(P<0.01)；在吡虫啉浓度为田间推荐使用剂量(100 mg/L)时，昆虫病原线虫的死亡率为10.67%，5倍田间推荐使用剂量(500 mg/L)时，昆虫病原线虫死亡率为41.14%，均未超过50%，说明昆虫病原线虫对吡虫啉，在田间推荐使用浓度下，有较强的耐药性.综上所述，在低剂量下(0.5倍田间推荐浓度)，吡虫啉对昆虫病原线虫无毒性，因此昆虫病原线虫可以与吡虫啉(剂量减半)混用来防治韭菜异迟眼蕈蚊幼虫.以安全系数为标准，对吡虫啉进行安全性评价.经计算吡虫啉对昆虫病原线虫的安全系数为5.95，大于5.00，为低风险性农药.
图2 吡虫啉对昆虫病原线虫的毒性测定Figure 2 Toxicities of imidacloprid on entomopathogenic nematodes
表1 昆虫病原线虫对吡虫啉的耐药性测定
小写字母表示不同浓度处理之间的差异显著(P<0.05)，大写字母表示不同浓度处理之间的差异显著(P<0.01).
Lower-case letters indicate significant differences between treaments with different corcentrations,capital letters indicate significant differences between treaments of different concentrations.
表2 吡虫啉对昆虫病原线虫的安全性评价
安全性评价A为RQ≤0.05(极高风险)；B为0.05
A：RQ≤0.05(Very high-risk)；B：0.05≤RQ≤0.50(high-risk)；C：0.50≤RQ≤5.00(medium risk)；D：RQ>5.00(low risk).
2.4 昆虫病原线虫与吡虫啉混配对韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的毒力测定
由试验结果(图3)可知，昆虫病原线虫(浓度为1 000 IJs/mL)与低剂量吡虫啉药剂混配时，其对异迟眼蕈蚊的毒力较单用昆虫病原线虫或吡虫啉时，均显著增高，且随吡虫啉浓度升高，异迟眼蕈蚊校正死亡率升高.在昆虫病原线虫浓度为1 000 IJs/mL，吡虫啉药剂浓度为4 mg/L(靶标昆虫1/4LC50)时，韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的死亡率为26.7%；吡虫啉药剂浓度为升高至10 mg/L(单用3/4LC50)时，韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的死亡率为73.3%，较单用吡虫啉时43.3%显著升高，且差异显著(P<0.05).
计算出毒力回归方程为y=5.557x+0.277,LC50=7.08 mg/L，相关系数r=0.951， 95%置信区间为4.716～6.398.吡虫啉与EPN混用时致死中浓度LC50=7.08 mg/L，为单用吡虫啉LC50=14.77 mg/L的1/2，大大降低了吡虫啉的用量.综上所述，低剂量吡虫啉与昆虫病原线虫混配，具有明显的增效作用，比单用吡虫啉或昆虫病原线虫时的毒力更大，达到农药减量施用，但对异迟眼蕈蚊控制效能提高.
图3 昆虫病原线虫与吡虫啉混配对异迟眼蕈蚊的毒力测定Figure 3 Virulence ofEntomopathogenic nematodesand imidacloprid againstBradysia odoriphaga
3 讨论
吡虫啉作用于昆虫神经系统烟碱型乙酰胆碱(nACh)受体，并与突触部位乙酰胆碱结合，是一种高效杀虫剂，在目前韭蛆(迟眼蕈蚊和异迟眼蕈蚊幼虫)的防治中广泛应用.本试验中吡虫啉对异迟眼蕈蚊幼虫LC50=14.77 mg/L，这与王志超等[13]研究吡虫啉对迟眼蕈蚊的毒力测定结果相一致(LC50=12.68 mg/L)，说明吡虫啉对韭菜产业中主要害虫韭蛆—迟眼蕈蚊和异迟眼蕈蚊均有较高的毒力，在田间具较高的控制效能.
昆虫病原线虫对不同化学农药的敏感性存在差异[14-15]，混用时首先应考虑化学药剂对昆虫病原线虫的毒性.本试验中，低浓度吡虫啉对昆虫病原线虫存活率无显著影响，说明低浓度(0.5倍田间推荐浓度)吡虫啉对昆虫病原线虫无毒性，是安全的，因此低浓度吡虫啉可以与昆虫病原线虫混合使用处理韭菜异迟眼蕈蚊幼虫.这与国内外许多研究，昆虫病原线虫与吡虫啉混用防治褐纹甘蔗象[16]、侵染暗黑鳃金龟[6]、韭菜迟眼蕈蚊[11]的试验结果一致.
另外，项目组在研究过程中发现，昆虫病原线虫和吡虫啉混用后，其对异迟眼蕈蚊毒力大大升高，与其他药剂+线虫混用差异显著(数据未发表)，因此本试验仅测定了昆虫病原线虫与吡虫啉混用对韭菜异迟眼蕈蚊的毒力，而不同种类昆虫病原线虫与不同药剂混用对异迟眼蕈蚊的毒力测定，有待进一步研究.
吡虫啉单用时，较其他种类农药对异迟眼蕈蚊的毒力不是最高，且处于偏低，但是和昆虫病原线虫混用后，其毒力明显升高.昆虫病原线虫Steinernemafeltiae0619HT品系以1 000 IJs/mL并与3/4LC50即10 mg/L(LC50为吡虫啉对韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的致死中浓度)的吡虫啉混配，韭菜异迟眼蕈蚊幼虫的死亡率达73.3%，与单用吡虫啉时43.3%差异显著.因此，昆虫病原线虫与吡虫啉混配防治韭菜异迟眼蕈蚊幼虫具有明显的减量增效作用.这与孙瑞红等[7]通过昆虫病原线虫H06与化学杀虫剂对韭菜迟眼蕈蚊的联合作用，王果红等[16]利用昆虫病原线虫与化学农药混用防治褐纹甘蔗象，结果相似.前人研究结果显示，生物或非生物药剂与昆虫病原线虫混用使用后，减量增效主要由以下3方面原因：药剂本身对靶标昆虫无毒力，但与EPN混配使用后，药剂能刺激EPN感受神经使线虫兴奋、活跃，因此可提高线虫搜寻、攻击和侵染靶标昆虫的效能；药剂本身对靶标昆虫具一定的毒力，药剂刺激线虫，再提高药剂毒力；药剂本身对靶标昆虫有毒力，且可降低其对线虫的防御能力，从而有利于线虫的入侵[17-20].本试验中，昆虫病原线虫与吡虫啉混配使用表现出的增效作用应与上述原因有关，但其具体作用机理有待进一步展开研究.
昆虫病原线虫和不同的农药混用后，对不同的靶标昆虫，其毒力变化不同，关于昆虫病原线虫与不同种类农药混用，对生产中常见的主要害虫的毒力变化将在后期进一步研究探讨.且农药混配共毒系数是衡量杀虫剂混剂是否有增效作用的指数，而关于农药与生物杀虫剂混配的评价是否可以参考共毒系数，也是值得进一步探讨的问题.
目前，我国大力发展无公害蔬菜[21]，国家重点研发“双减”项目，也是为实现无公害蔬菜生产的一项重要举措，因此昆虫病原线虫与吡虫啉混用实现减量增效的防治效果，对韭蛆的无公害防治具有重要的实践意义.
4 结论
吡虫啉对异迟眼蕈蚊幼虫具有较高的毒力，且药剂浓度越高，其控制效能越好，LC50=14.77 mg/L，相关系数r=0.913；在低剂量下(0.5倍田间推荐浓度)，吡虫啉对昆虫病原线虫无毒性，因此昆虫病原线虫可以与吡虫啉(剂量减半)混用来防治韭菜异迟眼蕈蚊幼虫；昆虫病原线虫Steinernemafeltiae0619HT品系以1 000 IJs/mL 与低剂量(3/4LC50即10 mg/L)吡虫啉混用，对异迟眼蕈蚊的毒力增强，具有明显的增效作用，可起到吡虫啉减量增效的效果.
