甜叶菊叶中总黄酮的提取及其抗氧化活性测定

宋巧,童红梅,郭敏,王保平,彭涛,张敏

(1.甘肃医学院，甘肃 平凉 744000；2.兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730000)

甜叶菊(Steviarebaudiana)是原产于南美洲巴拉圭的1种菊科植物[1]，其叶片富含甜叶菊糖苷和黄酮类成分[2].甘肃省酒泉市肃州区因气候干燥、光照充足、昼夜温差大、太阳辐射强、沙石土壤等特殊气候及地质条件，种植甜叶菊具有明显优势，产品品质及有效成分含量均高于国内其他地区[3].目前，甜叶菊在甘肃省酒泉市肃州区种植面积达2 500 hm2，种植户达到12 000余户，甜菊干叶产量达5 250 kg/hm2，高于国内其他地区，具有丰富的甜叶菊资源，但其开发利用价值较低[4].

黄酮类化合物生理活性广泛且毒副作用少，具有广泛的药用功效[5-7].文献报道，黄酮具有多种生理功能如抗心脑血管病、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗过敏、免疫调节等作用，已经被广泛应用到食品、医药和保健品等领域[8-10].

由于我国对甜叶菊研究的起步较晚，目前对甜叶菊的研究主要集中在甜菊糖苷的提取、栽培技术和病害防治技术、离体培养技术等方面[6-7,11-12]，对甜叶菊其他活性成分的研究还较为薄弱.目前，在对甜叶菊总黄酮提取工艺和抗氧化活性的研究中，主要集中在针对甜叶菊渣及发酵制剂抗氧化活性的研究方面[7,13-14]，但对甜叶菊主体产物—甜叶菊叶中黄酮类化合物的提取和抗氧化活性研究鲜有报道.为进一步挖掘甜叶菊叶的综合利用价值，缓解甜叶菊资源过剩的问题，本试验以酒泉市肃州区种植的甜叶菊叶片为原料，总黄酮提取量为检测指标，采用单因素、正交试验设计对甜叶菊叶总黄酮的提取工艺条件进行优化研究，确定其最佳提取工艺，并对甜叶菊叶黄酮提取物的抗氧化性进行检测，旨在为合理开发甜叶菊资源提供必要的科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜叶菊叶于2017年7月采购于甘肃省酒泉市甜叶菊种植基地，置于烘箱中70 ℃烘干，研磨过200目筛后备用.芦丁标准品，色谱纯，中国药品生物制品鉴定所；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、盐酸，均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司.

1.2 仪器与设备

722E型可见光分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；MS205DU天平(梅特勒-托利多国际有限公司)；VORTEX-5 涡旋混合仪器(广州启达环保设备有限公司)；DHG-9140(A)电热恒温鼓风干燥箱(上海予华仪器设备有限公司)；SBL-15DT超声波恒温清洗机(上海生科仪器有限公司)；SHB-IV双A型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；XA-1型高速万能粉碎机(南京旭析仪器有限责任公司)；Galanz微波炉G80F23ESL-XGA(B0)(广东格兰仕集团有限公司).

1.3 研究方法

1.3.1 甜叶菊残渣中总黄酮浸提量的测定

1.3.1.1 芦丁标准曲线的绘制 精准称取芦丁标准品7.50 mg置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液使之溶解并定容至刻度，涡旋混匀，即得0.30 mg/mL芦丁标准溶液.分别准确吸取芦丁标准溶液0.00、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mL，(相当于总黄酮的质量分别为0.00、0.09、0.18、0.27、0.36、0.45 mg)置于10 mL容量瓶中，加入0.2 mL的0.05 g/mL亚硝酸钠溶液，混匀后静置6 min，然后加入0.2 mL 的0.1 g/mL硝酸铝溶液，混匀后静置6 min，再加入2.0 mL的1.0 mol/L氢氧化钠溶液，用60%乙醇溶液定容，涡旋混匀后静置15 min使其充分反应，于510 nm波长处分别测定各反应体系的吸光度值.以总黄酮质量x为横坐标，吸光度值y为纵坐标，绘制标准曲线.线性回归方程为：y=0.347 0x-0.028 2，决定系数r2=0.998 5.

1.3.1.2 样品处理及总黄酮浸提量的计算 准确称取甜叶菊叶样品10 g，液氮中研磨，依次在不同超声提取时间、固液比、超声提取温度、乙醇浓度(V/V)条件下进行功率为400 W超声波提取的单因素试验，提取液再经微波提取30 s，抽滤后用60%乙醇溶液定容至一定体积V，精确吸取一定体积的提取液V0，根据1.3.1.1的方法处理待测液，于510 nm波长处测定其吸光度值，根据标准曲线计算总黄酮浸提量.总黄酮浸提量计算见式(1)：

总黄酮浸提量(mg/g)=根据标准曲线计算的总黄酮含量M(mg)/测定液体积V0(mL)×定容体积V(mL)/甜叶菊叶质量m(g)

(1)

1.3.2 甜叶菊叶中总黄酮提取工艺优化

1.3.2.1 单因素试验设计 参考文献方法[6,15]，对甜叶菊叶液氮冻干研磨样品，在超声提取时间为60 min、超声提取温度60 ℃、乙醇浓度70%(V/V)在固液比1∶15(g∶mL)的条件下，固定其他条件不变，设置超声提取时间为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min，料液比为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，超声提取温度为20、30、40、50、60、70、80、90 ℃，乙醇浓度20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，以总黄酮提取量为指标，进行单因素试验，每个试验重复3次.按照1.3.1.2测定并计算各处理的总黄酮提取量.

1.3.2.2 正交试验设计 在单因素试验的基础上，进行四因素三水平的正交试验.采用L9(34)正交表进行组合搭配，以总黄酮提取量为评价指标进行比较，优化工艺参数.每个试验重复3次，用极差分析法对试验结果做直观分析.

1.3.3 甜叶菊叶中总黄酮对·OH的清除率测定[6]参照文献方法，将甜叶菊叶提取液稀释至质量浓度分别为10、20、30、40 mg/L，准确吸取2 m L上述稀释液，依次添加6 mmol/L的FeSO4溶液2.0 mL、6 mmol/L的H2O2溶液2.0 mL，涡旋混匀后室温条件下静置10 min，再添加6 mmol/L水杨酸2.0 mL，混匀，室温条件下静置30 min，于510 nm波长处的吸光度Ai；同时测定用去离子水替换水杨酸时的吸光度Aj.校准液是用去离子水替换总黄酮溶液，然后测定其吸光度为A0，测定其对·OH清除率.按照相同方法，分别加入相同质量浓度的VC样液作为对照，测定VC对·OH清除率.·OH清除率计算见式(2).

·OH清除率/%=[1-(Ai-Aj)]×100/A0

(2)

1.3.4 甜叶菊叶中总黄酮对超氧阴离子自由基(O2-·)的清除率测定[16-17]依据文献的方法，取7支试管，分别加入4.5 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1缓冲液，再分别加入质量浓度为0.250 mg/mL的甜叶菊叶黄酮提取液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6 mL，然后用水补齐至9.7 mL，混匀，恒温20 min(25 ℃)，加0.3 mL 3 mmol/L邻苯三酚溶液(25 ℃)开启反应，5 min后加4滴10 mol/L盐酸终止反应.同时另取7支试管，用0.3 mL 10 mmol/L盐酸为空白对照开启反应，同上操作终止反应.于325 nm分别测定吸光值A.以VC作为对照，按照相同方法，分别加入浓度为0.250 mg/mL的VC样液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6.测定其对O2-·清除率.按照式(3)计算O2-·的清除率.

O2-·清除率/%=(A对照-A加样)×100/A对照

(3)

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声提取时间对甜叶菊叶总黄酮提取效果的影响 由图1可知，在超声提取时间在于60 min时，总黄酮提取量随着时间的延长而提高，但当超声提取时间多于60 min后总黄酮提取量却随时间的延长而降低，这可能是由于随着超声时间延长，超声效果不断增强，造成黄酮结构破坏[18]，这与陈婷等[7]人的研究结果一致.因而，当其他条件保持不变的时候，超声提取时间设置为60 min有最大的黄酮提取量.

图1 超声提取时间对甜叶菊叶中总黄酮提取量的影响Figure 1 Effect of ultrasonic extracting time on the extraction yield of total flavonoids from stevia leaves

2.1.2 固液比对甜叶菊叶总黄酮提取效果的影响 由图2可知，在一定条件下总黄酮的提取量随着料液比的降低而增加，并且总黄酮提取量的上升趋势逐渐减缓，当料液比达到1∶20时提取率达到最大，之后总黄酮提取量逐渐减小，因此选取料液比1∶20为最佳料液比.

图2 固液比对甜叶菊叶中总黄酮提取量的影响Figure 2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids from stevia leaves

2.1.3 超声提取温度对甜叶菊叶总黄酮提取效果的影响 由图3可知，随着超声温度的提高，甜叶菊叶中总黄酮提取量逐步增加，当超声温度达到60 ℃时，总黄酮提取量达到最大值，当温度继续升高后，总黄酮的提取量较平稳，甚至略有降低.可能原因为：较高温度下，分子运动速率加快使杂质含量增多，同时使一部分稳定性不好的黄酮类化合物氧化分解而损失[19].考虑到尽可能降低高温对总黄酮的散失和同时获得较理想的提取率，选择60 ℃为黄酮提取的最佳温度.

图3 超声提取温度对甜叶菊叶中总黄酮提取量的影响Figure 3 Effect of ultrasonic extraction temperature on the extraction yield of total flavonoids from stevia leaves

2.1.4 乙醇体积分数对甜叶菊叶黄酮提取效果的影响 由图4可知，在乙醇溶液浓度低于70%时，随着乙醇体积分数的增大，总黄酮提取量增加；当乙醇溶液浓度高于70%以后，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取量却在减小.说明乙醇体积浓度过大，使醇溶性杂质不断增加而降低总黄酮提取量[20].因此，乙醇浓度(V/V)为70%时总黄酮浸提量最高，为5.839 mg/g.

图4 乙醇浓度(V/V)对甜叶菊叶中总黄酮提取量的影响Figure 4 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids from the leaves of stevia

2.2 正交试验设计及结果

对表1结果进行直观分析可知，RA>RB>RD>RC，影响效果的主次因素为：超声提取时间>固液比>乙醇浓度(V/V)>超声提取温度.从各因素水平对甜叶菊叶中总黄酮提取量的影响来看，K2A>K3A>K1A，说明超声提取时间60 min时总黄酮提取量最大；在固液比这个因素中，K3B>K2B>K1B，说明固液比1∶20时总黄酮提取量最大；在超声提取温度因素中，K2C>K3C>K1C，说明超声提取时间为70 ℃时总黄酮提取量最大；在乙醇浓度(V/V)因素中K2D>K1D>K3D，说明乙醇浓度(V/V)为70%时，总黄酮提取量最大.由K值可知最佳工艺组合为A2B3C2D2.

表1 总黄酮提取工艺优化正交试验设计与结果表

用SPSS 17.0统计软件对试验结果进行方差分析，结果如表2所示.超声提取时间对总黄酮提取率有极显著性影响(P<0.01)，固液比对总黄酮提取率影响显著(P<0.05)，超声提取温度和乙醇浓度(V/V)对甜叶菊叶总黄酮提取率影响不显著.这与表1中的极差分析结果相吻合.

表2 方差分析表

2.3 验证试验结果

由于正交试验得到的最优组合A2B3C2D2，在L9(34)正交试验设计中没有出现，需进行验证试验.在超声提取时间60 min、固液比1∶20、超声提取时间70 min、乙醇浓度(V/V)70%的条件下，进行了3次重复验证试验，结果表明甜叶菊叶中总黄酮的平均提取量为6.672 mg/g(3次提取量分别为6.678、6.669、6.669 mg/g)，高于单因素试验的结果和正交试验结果，同时也高于文献[7]报道的甜叶菊残渣中总黄酮的提取率(5.928 mg/g).

2.4 甜叶菊叶中总黄酮对·OH的抗氧化性

甜叶菊叶总黄酮提取物和VC对·OH的清除率见图5.相关研究表明[15,21]，黄酮类化合物可以有效的清除自由基，阻止脂质过氧化对细胞的破坏作用，从而使细胞达到抗氧化的效果.试验结果表明，甜叶菊叶中黄酮和VC均对·OH有较高的清除率，甜叶菊叶的IC50(即清除率达到50%时所需样品的质量浓度)为25.031 mg/L时，VC的IC50为19.583 mg/L，两者对·OH的抗氧化性在同等条件下，甜叶菊叶中总黄酮的质量浓度是VC质量浓度的1.28倍.虽然VC对·OH的抗氧化性要强于甜叶菊叶中黄酮，但从图5可以看出，甜叶菊叶中黄酮在一定范围内随着黄酮质量浓度的增大，其清除率不断增大，对·OH仍有较为明显的清除作用.

图5 甜叶菊叶总黄酮提取物和VC对·OH的清除率Figure 5 Scavenging ratio of the total flavonoids extract from stevia leaves and VC against hydroxyl free radicals

2.5 甜叶菊叶中总黄酮对O2-·的抗氧化性

甜叶菊叶总黄酮提取物和VC对O2-·的抗氧化性见图6.由表6可以看出，甜叶菊叶中总黄酮和VC样液均对O2-·有较为明显的清除能力，两者对其的清除率均与样液的质量浓度呈正相关增长.在质量浓度为16.867 mg/mL以上的范围内时，VC对O2-·的清除率均强于甜叶菊叶中总黄酮，当VC样液的质量浓度为25.481 mg/mL时，对O2-·清除率达到50%，而甜叶菊叶总黄酮的IC50为28.677 mg/mL，说明两者对O2-·的抗氧化性在同等条件下，甜叶菊叶中总黄酮的质量浓度是VC质量浓度的1.13倍；但质量浓度低于16.867 mg/mL时，甜叶菊叶中总黄酮对O2-·的清除率要强于VC.

图6 甜叶菊叶总黄酮提取物和VC对O2-·的抗氧化性Figure 6 Scavenging ratio of the total flavonoids extract from stevia leaves and VC against superoxide anion free radicals

3 结论

1) 利用超声波辅助技术提取甘肃省酒泉市肃州区所产甜叶菊叶中的总黄酮进行提取，其最佳工艺条件为超声提取时间60 min、固液比1∶20、超声提取温度70 ℃、乙醇浓度(V/V)70%，此条件下提取甜叶菊叶的总黄酮量为6.672 mg/g.本工艺提取甜叶菊渣中总黄酮，简单易行，成本低廉，安全可靠，有利于甜叶菊资源的合理利用.

2) 抗氧化实验结果表明，甜叶菊叶中总黄酮具有较好的清除·OH和O2-·的能力.对·OH 的抗氧化能力上，甜叶菊叶中总黄酮的IC50为25.031 mg/L，是VC的1.28，其稍弱于VC.对O2-·的抗氧化能力上，甜叶菊叶中总黄酮的IC50为28.677 mg/mL，是VC的1.13倍；在质量浓度为16.867 mg/mL以上的范围内时，甜叶菊叶中总黄酮的抗氧化能力弱于VC；质量浓度低于16.867 mg/mL时，甜叶菊叶中总黄酮的抗氧化能力要强于VC.因此，甘肃省酒泉市肃州区甜叶菊叶中黄酮类化合物有较好的抗氧化能力，是一种很好的天然自由基清除剂，在抗衰老、提高免疫等方面发挥着重要作用.