Cd2+对克氏原螯虾肝胰腺NF-κB p65表达的影响

宋昌霞，魏克强

（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

近年来，我国水域环境的污染状况日益严峻，重金属镉是典型的污染物之一，能对水生动物造成氧化应激、免疫损伤等毒性效应，严重危害了水生动物健康[1-4]。克氏原螯虾（Procambarus clarkii）是我国主要的淡水养殖品种之一，还是一种潜在的水质环境污染的指示生物[5]。肝胰腺是甲壳动物重要的免疫和解毒器官[6-7]。研究表明，NF-κB 是进化保守的氧化还原敏感的转录因子，其家族成员p65（RelA）在天然免疫反应中具有重要作用[8]。目前还发现，在甲壳动物等低等无脊椎动物细胞内也存在该蛋白的类似物，其mRNA 主要在肝胰腺表达和分布[9]。

本研究以亚致死浓度的Cd2+为胁迫因子，利用免疫组化法（IHC）分析了不同浓度Cd2+对克氏原螯虾肝胰腺NF-κB p65 表达的影响，旨在为甲壳动物的免疫毒理学研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

健康克氏原螯虾（体长为（9±0.5）cm，体质量为（21.2±4.2）g），购于太原市五龙口水产市场。试验前于曝气充足的玻璃缸中暂养7 d，水温为（16±1）℃，pH 值为 6.5±0.2，试验前 24 h 不再喂食。

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂有多聚甲醛、无水乙醇、二甲苯、石蜡、苏木素、伊红、氨水、中性树胶、柠檬酸等，均为国产分析纯；NF-κB p65 多克隆抗体（Proteintech，武汉），兔IgG SABC 免疫组化试剂盒（博士德，武汉），DAB 试剂盒（索莱宝，北京）。

仪器主要有石蜡切片机（Leica RM2255，德国），CO2恒温培养箱（HH.CP-7 型，上海），光学显微镜（Olympus BX51，日本）等。

1.3 试验方法

1.3.1 染毒与取样 采用静态水质接触染毒法。确定 96 h 半致死浓度（LC50≈42 mg/L）后，随机分为3 个处理组：健康对照组和1.0，5.0 mg/L Cd2+染毒组，每组6 只。染毒96 h 后，随机取3 尾，置于冰上麻醉，解剖取肝胰腺组织，4%多聚甲醛固定48 h。

1.3.2 肝胰腺组织H.E.染色 其参照文献[10]的方法进行。将固定的肝胰腺组织进行常规石蜡包埋、切片（5 μm），苏木素、伊红染色后，中性树胶封片，显微镜观察拍照。

1.3.3 免疫组化法检测 参照文献[11-12]的方法，石蜡切片常规脱蜡，免疫组化三步法（SABC 法）检测 NF-κB p65 的表达，DAB 显色，苏木精复染，中性树胶封片，显微镜观察拍照。每张切片随机选取5 个视野，使用Image-ProPlus 6.0 软件读取每个视野下阳性物质表达区域的平均光密度值（MOD）。

1.4 数据处理

采用SPSS 17.0 软件处理数据，所有结果均以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 组织切片病理观察

H.E.染色显示，健康螯虾的肝胰腺组织结构完整，由肝小管及上皮细胞组成，主要为B 细胞（存储细胞）和R 细胞（分泌细胞）；在Cd2+胁迫下，肝胰腺组织破损，肝小管官腔变窄，R 细胞排列紊乱、少量B 细胞破裂（图1-A）。

2.2 肝胰腺组织的NF-κB p65表达

免疫组化分析表明，正常状况下，NF-κB p65主要在B 细胞的胞质中表达且维持在较低的水平。Cd2+胁迫下，其表达水平分别是对照的6 倍和12 倍（P＜0.01），且 5 mg/L 组与 1 mg/L 组间差异显著（P＜0.01）（图1-B～E）。

3 结论与讨论

核转录因子 NF-κB 由 NF-κB/Rel 蛋白家族构成，通常多以p65 和p50 的异二聚体形式存在。一般情况下，NF-κB 处于非活化状态，与抑制蛋白IκB 结合处于胞质中。当细胞被刺激后，会使 IκB 发生磷酸化，从而与NF-κB 脱离，p65 从细胞质中迁移进入细胞核内，调控免疫有关的靶基因的转录表达[13-15]。

肝胰腺是甲壳动物主要的解毒器官，也是重金属Cd2+蓄积的主要组织[16]。毒性Cd2+导致超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢等活性氧自由基（ROS）的产生增多，激活氧化还原敏感的转录因子[17]。一些研究表明，NF-κB 是 ROS 的主要靶点[18-20]。本研究的结果显示，Cd2+暴露能够导致肝胰腺组织的NF-κB p65 蛋白含量显著升高（P＜0.01）；低质量浓度Cd2+处理的表达量明显低于高质量浓度处理，这可能由于在低质量浓度的Cd2+暴露后，机体产生的过量ROS，通过抗氧化防御系统清除了部分ROS。而在高质量浓度Cd2+暴露后，机体产生的过量ROS无法通过自身清除，进一步激活NF-κB 信号通路，使NF-κB p65 蛋白大量表达。谭树华等[6]研究了镉对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化系统的影响，也表明了类似的规律，即低浓度镉胁迫下典型抗氧化酶活力增加，高浓度暴露则对机体造成抗氧化防御系统的损伤。这提示，细胞NF-κB p65 的表达与胞内的ROS 水平密切相关，这可能是水体重金属镉暴露导致甲壳动物的毒性效应之一，其如何影响螯虾的细胞免疫、体液免疫，还需进一步深入研究。