知柏龙胆片质量标准的研究

李 洁， 杨 骏， 何 琳， 陆蕙兰

（上海市黄浦区香山中医医院药剂科， 上海 200020）

近年来研究发现， 应用滋阴降火中成药治疗儿童性早熟的疗效显著， 并通过动物模型阐释其机理[1-3］。 知柏龙胆片（SYZ-ZF-087-2005） 源于上海市黄浦区香山中医医院中医内科经验方， 为补阴名方大补阴丸化裁而得， 是由黄柏、知母、 熟地黄、 醋龟甲、 龙胆5 味药材组成的中药复方制剂， 具有滋阴降火之功效， 临床用于治疗生长发育加速（性早熟）[4］。 但目前该制剂质量标准过于简单， 而中药方剂由多味药材组成[5］， 常以“君臣佐使” 规律相互制约和协调， 强调从整体上发挥作用， 仅靠单一成分难以全面反映其内在质量。 因此， 在已有研究基础上， 本实验增加知柏龙胆片中黄柏、 龙胆、 龟甲、 知母等药材的定性定量测定， 以保证临床用药安全有效[6-7］、 含有量均一[8］， 并完善其质量控制体系。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）， 配置VWD 检测器； Phenomenex C18、 Shiseido C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； AUW220D 电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］； XP205 电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； Scanner3＆Linomat5 薄层扫描仪（瑞士卡玛公司）； HWS26 恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）； 202-1A 真空干燥箱（上海沪南科学仪器联营厂）； SK7210HP 超声仪（上海科导超声仪器有限公司）； DFY-400 粉碎机 （上海精广机械设备有限公司）； TC-15 电热套（海宁新华医疗器械厂）。

1.2 饮片 黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid. 干燥树皮的炮制品 （产地四川， 批号16041302）， 知 母 为 百 合 科 植 物 知 母 Anemarrhena asphodeloides Bge. 干燥根茎的炮制品 （产地河北， 批号16120803）， 熟地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch. 干燥块根的炮制品（产地河南， 批号16051702），醋龟甲为龟科动物乌龟Chinemys reevesii （Gray） 背甲及腹甲的炮制品（产地广东， 批号17011702）， 龙胆为龙胆科植物龙胆Gentiana scabra Bunge. 干燥根和根茎的炮制品（产地辽宁， 批号17010303）。 以上饮片均购自上海华济药业有限公司， 经上海中医药大学专家鉴定为正品。

1.3 试药 芒果苷（批号111607-200402）、 知母皂苷BⅡ（批 号 111839-201102）、 盐 酸 小 檗 碱 （批 号 110713-201613）、 赖氨酸（批号L103479）、 亮氨酸（批号140687-201102）、 缬氨酸（批号140681-200401）、 龙胆苦苷（批号110770-201515） 对照品均购自中国食品药品检定研究院。 知柏龙胆片（批号170301、 170601、 170801）， 由上海市黄浦区香山中医医院提供。 乙腈、 甲醇为色谱纯（德国Merck 公司）； 其余试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 TLC 定性鉴别

2.1.1 醋龟甲 取本品适量， 研碎至细粉， 称取1 g， 加10 mL 水加热至沸， 放冷， 离心（10 000 r／min） 10 min，取上清液， 作为供试品溶液； 取处方中除醋龟甲外其余饮片， 按照生产工艺制备缺醋龟甲阴性供试品， 同法制成相应溶液； 取赖氨酸、 亮氨酸、 缬氨酸对照品， 加水制成每1 mL 分别含1、 1、 0.5 mg 上述成分的溶液， 作为对照品溶液。 按照2015 年版《中国药典》 四部薄层色谱法（通则0502）， 吸取阴性供试品溶液5 μL、 3 种对照品溶液各5 μL、 供试品溶液10、 2 μL， 点于同一硅胶G 薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4 ∶1 ∶1） 为展开剂， 展开， 取出，晾干， 喷以茚三酮试液， 105 ℃下加热至斑点显色清晰，结果见图1。 由图可知， 供试品色谱在对照品（点样量10 μL） 相应位置上显相同颜色斑点[9-10］， 阴性无干扰， 同时在2 μL 点样量下斑点较淡， 故选择点样量为10 μL。

图1 醋龟甲TLC 色谱图

2.1.2 知母 取本品适量， 研碎至细粉， 称取1 g， 加10 mL稀乙醇超声（53 kHz、 20 ℃） 20 min， 放冷， 离心（10 000 r／min） 10 min， 取上清液， 作为供试品溶液； 取处方中除知母外其余饮片， 按照生产工艺制备缺知母阴性供试品， 同法制成相应溶液； 取芒果苷对照品， 加稀乙醇制成每1 mL 含1.0 mg 该成分的溶液， 作为对照品溶液。按照2015 年版 《中国药典》 四部薄层色谱法 （通则0502）， 吸取对照品溶液5 μL、 供试品溶液10 μL、 阴性供试品溶液5 μL， 点于同一聚酰胺薄膜上， 以乙醇-水（1 ∶1） 为 展 开 剂， 展 开， 取 出， 晾 干， 置 于 紫 外 光 灯（365 nm） 下检视， 结果见图2。 由图可知， 供试品色谱在对照品相应位置上显相同颜色荧光斑点， 阴性无干扰。

图2 知母TLC 色谱图

2.2 HPLC 含有量测定

2.2.1 盐酸小檗碱

2.2.1.1 色谱条件 填充剂十八烷基硅烷键合硅胶； 流动相乙腈-0.1%磷酸（50 ∶50） （每100 mL 加0.3 g 十二烷基磺酸钠）； 检测波长265 nm； 柱温30 ℃。 理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算， 应不低于4 000。

2.2.1.2 供试品溶液制备 取本品10 片， 研碎至细粉，精密称取0.5 g， 置于锥形瓶中， 精密加入75% 甲醇100 mL， 称定质量， 回流45 min， 冷却， 75% 甲醇补足减失的质量， 摇匀， 0.22 μm 微孔滤膜过滤， 取续滤液，即得。

2.2.1.3 阴性供试品溶液制备 根据处方比例取除黄柏外其余饮片， 按照生产工艺制备缺黄柏供试品， 按“2.2.1.1” 项下方法制备， 即得。

2.2.1.4 对照品溶液制备 精密称取盐酸小檗碱对照品适量， 加甲醇制成每1 mL 含21.52 μg 该成分的溶液， 即得。

2.2.1.5 专属性考察 检测波长选择2015 年版《中国药典》 一部黄柏项下的265 nm， 对照品、 供试品、 阴性供试品溶液在“2.2.1.1” 项色谱条件下进样测定， 发现阴性无干扰， 色谱图见图3。

图3 盐酸小檗碱HPLC 色谱图

2.2.1.6线性关系考察 精密称取盐酸小檗碱对照品适量， 流动相制成1.076 mg／mL 贮备液， 稀释10 倍， 精密吸取适量， 甲醇制成2.152、 4.304、 10.76、 21.52、 53.80、107.6、 215.2 μg／mL 对照品溶液， 在“2.2.1.1” 项色谱条件下进样10 μL 测定。 以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归， 得方程为Y=42.607X＋10.231 （r=1）， 在2.152～215.2 μg／mL 范围内呈良好的线性关系。

2.2.1.7 精密度试验 精密吸取对照品溶液（21.52 μg／mL）10 μL， 在“2.2.1.1” 项色谱条件下进样测定， 测得盐酸小檗碱峰面积RSD 为0.99%， 表明仪器精密度良好。

2.2.1.8 稳定性试验 取本品（批号170301） 适量， 按“2.2.1.2” 项下方法制备供试品溶液， 室温下于0、 2、 4、6、 8、 10、 12、 24 h 在“2.2.1.1” 项色谱条件下进样测定， 测得盐酸小檗碱峰面积RSD 为1.10%， 表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.1.9 重复性试验 取本品（批号170301） 6 份， 按“2.2.1.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.2.1.1” 项色谱条件下进样测定， 测得盐酸小檗碱含有量RSD 为1.93%， 表明该方法重复性良好。

2.2.1.10 加样回收率试验 精密称取9 份盐酸小檗碱含有量已知（2.91 mg／g） 的本品， 每份0.25 g， 加入对照品溶液（2.51 mg／mL） 0.15、 0.3、 0.45 mL， 各3 份， 分别相当于取样量的0.5、 1、 1.5 倍， 按“2.2.1.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.2.1.1” 项色谱条件下进样测定，结果见表1。

表1 盐酸小檗碱加样回收率试验结果（n=9）

2.2.2 龙胆苦苷

2.2.2.1 色谱条件 填充剂十八烷基硅烷键合硅胶； 流动相甲醇-水（25 ∶75）； 检测波长270 nm； 柱温30 ℃。 理论塔板数按龙胆苦苷峰计算， 应不低于3 000。

2.2.2.2 供试品溶液制备 取本品10 片， 研碎至细粉，精密称取0.5 g， 置于锥形瓶中， 精密加入50%乙醇25 mL，称定质量， 超声（53 kHz、 20 ℃） 45 min， 冷却， 50% 乙醇补足减失的质量， 摇匀， 0.45 μm 微孔滤膜过滤， 取续滤液， 即得。

2.2.2.3 阴性供试品溶液制备 根据处方比例取除龙胆外其余饮片， 按照生产工艺制备缺龙胆供试品， 按“2.2.2.2” 项下方法制备， 即得。

2.2.2.4 对照品溶液制备 精密称取龙胆苦苷对照品适量， 加甲醇制成每1 mL 含50.4 μg 该成分的溶液， 即得。

2.2.2.5 专属性考察 检测波长选择2015 年版《中国药典》 一部龙胆项下的270 nm， 对照品、 供试品、 阴性供试品溶液在“2.2.2.1” 项色谱条件下进样测定， 发现阴性无干扰， 色谱图见图4。

2.2.2.6 线性关系考察 精密称取龙胆苦苷对照品适量，甲醇制成0.100 8 mg／mL 贮备液， 精密吸取适量， 甲醇制成5.040、 10.08、 25.20、 50.40、 100.8、 201.6 μg／mL 对照品溶液， 在“2.2.2.1” 项色谱条件下进样10 μL 测定。以溶液质量浓度为横坐标（X）， 峰面积为纵坐标（Y） 进行回归， 得方程为Y=26.781X-0.622 8（r=1）， 在5.040～201.6 μg／mL 范围内呈良好的线性关系。

2.2.2.7 精密度试验 精密吸取对照品溶液（50.4 μg／mL）， 在“2.2.2.1” 项色谱条件下进样10 μL测定6 次， 测得龙胆苦苷峰面积RSD 为0.37%， 表明仪器精密度良好。

图4 龙胆苦苷HPLC 色谱图

2.2.2.8 稳定性试验 取本品（批号170301） 适量， 按“2.2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 室温下于0、 2、 4、6、 8、 10、 12、 24 h 在“2.2.2.1” 项色谱条件下进样测定， 测得龙胆苦苷峰面积RSD 为0.30%， 表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.2.9 重复性试验 取本品（批号170301） 6 份， 按“2.2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.2.2.1” 项色谱条件下进样测定， 测得龙胆苦苷含有量RSD 为0.96%， 表明该方法重复性良好。

2.2.2.10 加样回收率试验 精密称取9 份龙胆苦苷含有量已知（1.96 mg／g） 的本品， 每份0.25 g， 加入对照品溶液（1.74 mg／mL） 0.15、 0.25、 0.4 mL， 各3 份， 分别相当于取样量的0.5、 1、 1.5 倍， 按“2.2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.2.2.1” 项色谱条件下进样测定， 结果见表2。

表2 龙胆苦苷加样回收率试验结果（n=9）

2.2.3 样品含有量测定 取本品3 批 （批号170301、170601、 170801）， 按“2.2.1.2” 和“2.2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.2.1.1” 和“2.2.2.1” 项色谱条件下进样测定， 计算含有量， 结果见表3。 根据3 批平均含有量， 取其80%作为下限， 结合片剂质量0.3 g／片， 拟制定知柏龙胆片中盐酸小檗碱、 龙胆苦苷含有量分别不低于0.72、 0.45 mg／片。

表3 各成分含有量测定结果（n=3）

3 讨论

本实验采用硅胶G 薄层板作为固定相， 以正丁醇-冰醋酸-水（4 ∶1 ∶1） 为展开剂， 茚三酮试液为显色剂， 加热显色， 制订了龟甲TLC 定性鉴别项。 在制订知母TLC 定性鉴别项时， 发现以知母皂苷BⅡ为对照品无法消除阴性供试品干扰， 最终确立以芒果苷为对照品。

本实验在测定盐酸小檗碱含有量时， 考察了乙腈-磷酸二氢钾（50 ∶50） （每100 mL 加0.2、 0.3 g 十二烷基磺酸钠和0.2 g 磷酸二氢钾） 流动相[11］、 柱温、 检测波长、 色谱柱； 在制备供试品溶液时， 考察了提取方法（回流、 超声）、 提取溶剂（25%甲醇、 50%甲醇、 75%甲醇、 25%乙醇、 50%乙醇、 75% 乙醇）、 提取时间（15、 30、 45、 60、90 min）， 最 终 确 定 “2.2.1.1” 项 下 色 谱 条 件 和“2.2.1.2” 项下供试品溶液制备方法。 在测定龙胆苦苷含有量时， 流动相考察了乙腈-0.4% 磷酸（12 ∶88）[12］、 乙腈-水（12 ∶88）[13］， 发现分离度不好， 而“2.2.2.1” 项下色谱条件[14］可获得良好的分离效果， 而且基线平稳， 峰形对称。

4 结论

本实验建立TLC、 HPLC 法建立知柏龙胆片的质量标准， 该方法简便准确， 重复性好， 可为该制剂的质量控制提供参考依据。