亚热带北缘次生阔叶林土壤性状和菌根真菌多样性随坡位的变化

鄂晓伟，田野，李晓凤，马旭，徐叶宁

南京林业大学林学院/南京林业大学南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037

菌根是土壤真菌与植物根系在长期演化过程中形成的具有特定结构和功能的互利共生体（刘润进等，2007），是自然生态系统中广泛存在的共生现象。据估计，陆地生态系统中90%以上的植物根系都能形成菌根（Allen，1992）。菌根根据其共生方式可分为外生菌根、内生菌根和内外生菌根，而森林生态系统中通常以外生菌根类型占主导地位（Buee et al.，2005；Izzo et al.，2005）。森林生态系统中的许多木本植物的生长和生存都依赖于菌根。菌根释放的菌丝体作为寄主植物的主要营养器官的延展，能显著改善寄主植物对于水分和氮、磷等营养元素的吸收（Grelet et al.，2009；Leake et al.，2004；Singh et al.，2007）。菌根真菌的存在也可以影响根际土壤的理化性质，改变植物根际的微生物环境，最终影响寄主植物的生长（吴克，2003）。因此，菌根真菌的侵染和共生是林木适应瘠薄土壤条件和困难立地的有效方式。

菌根真菌在大多数生态系统中具有高度多样性，其组成和多样性的不同对寄主植物生长的影响也可能表现出“多样性效应”（Hoeksema et al.，2010；Koide，2010）。虽然影响菌根真菌多样性的机制仍然不清楚，但寄主植物特性以及土壤条件的差异可能对其具有关键性作用（Bruns，1995）。不同类型的菌根真菌利用土壤养分的能力不同，对非生物因子的适应能力也有所不同，这些因素都可能影响真菌与林木的共生过程，导致菌根的结构和功能表现出不同的差异。土壤养分及有机质含量会影响土壤真菌的侵染率，如N、P含量过高时会降低菌根真菌侵染率（安秀娟等，2007；孙玥等，2007；王晓英等，2009；钟思远等，2016）。

在山地生态系统中，坡位的差异会导致土壤的温、湿度以及养分等条件产生差异，从而可能影响菌根真菌的侵染及其群落结构特征。因此，把握菌根真菌的群落和种群结构特征对理解这些共生真菌种群在山地不同坡位森林生态系统中所起的作用至关重要（Egger，1994；Dahlberg et al.，1995；Dahlberg，2001）。

目前有关菌根真菌方面的研究多侧重于寒带、温带和热带，对亚热带的研究则主要集中在人工林方面，对地带性的阔叶林研究较少（Smith et al.，2008）。随着我国天然林保护和退耕还林等林业重点工程的实施，亚热带地区地带性次生阔叶林面积迅速增加。这些次生阔叶林多分布于土壤条件贫瘠、恶劣的山地，在其形成、恢复和演替过程中，与菌根真菌的共生可能是其适应该种立地的关键，因此研究菌根真菌的特性随自然立地条件的变化，在将来不断扩大的次生林管理方面有很大的参考价值。本研究以亚热带北缘丘陵山区处于不同坡位的天然恢复的次生阔叶林为研究对象，探讨由于坡位不同所引起的自然立地条件变化对林木菌根真菌侵染及多样性的影响，并分析菌根真菌侵染特征与土壤养分条件之间的关系，以期为次生阔叶林的经营管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

研究区位于江苏省句容市南京林业大学下蜀林场的空青山（N31°59′，E119°14′），属宁镇山脉东段的低山丘陵区，最高海拔 322.6 m。该地区属于亚热带季风气候区北缘，年均气温 15.2 ℃，年均降水量1005.6 mm。该区的地带性植被为带有常绿成分的落叶阔叶林，以壳斗科栎属落叶树种为主，是北亚热带向暖温带过渡的植被类型。该地区的土壤为在石英砂岩和砂页岩上发育而成的黄棕壤。

本研究以空青山东南坡面 1950年代初封山育林后恢复形成的次生落叶阔叶林为研究对象，林分群落保存完好。林分上层建群乔木以麻栎（Quercus acutissima）和栓皮栎（Q.variabilis）为主，含少量枫香（Liquidambar formosana）。小乔木和灌木层种类较多，主要包括短柄枹（Q.glandulifera）、白檀（Symplocos paniculata）、刺楸（Kalopanax septemlobus）、叶下珠（Phyllanthus urinaria）、杜鹃（Rhododendron simsii）、构骨（Ilex cornuta）、络石（Trachelospermum jasminoides）、菝葜（Smilax china）等。草本层较少，以麦冬（Ophiopogon japonicus）和少量蕨类植物为主。虽然山体海拔较低，但由于整体上为石质山地，坡度较大，岩石出露较多，土层浅薄，石砾含量高，立地条件差，主林层的高度从下坡到上坡也下降明显。本研究在次生阔叶林内根据主林层的大致生长情况，从上坡到下坡选择3个调查样区，用于调查土壤养分条件和菌根真菌侵染特征。调查样区的基本情况见表1。

1.2 样品采集及处理

于2016年7月在上、中、下3个坡位各随机选择3个10 m×10 m的重复取样小区，在每个小区内设置3个20 cm×20 cm的小样方，剪除地表全部林下植被，去除地表枯枝落叶层后，将样方内0－20 cm土层的土壤与根系全部取出，用自封袋密封后，置于4 ℃冰盒内低温保存并带回实验室，尽快将根系与土壤分离。新鲜土壤样品过2 mm筛去除石砾，测定含水量后，取一部分保存在4 ℃冰箱内，用于土壤无机氮含量和微生物生物量测定；另一部分样品风干，用于土壤pH值和有效磷含量以及土壤有机碳和全氮、全磷含量测定，其中土壤有机碳、全氮和全磷含量测定样品需进一步过0.1 mm筛。分离出的植物根系在静水中将附着的土壤颗粒轻轻抖落，然后用纯水润洗干净后，用吸水纸吸干水分，一部分保存于4 ℃冰箱，用于菌根真菌的侵染状况及菌根形态观察；另一部分保存于-80 ℃冰箱内，用于根系共生的菌根真菌DNA提取和后续的多样性分析。

1.3 分析测定方法

1.3.1 土壤含水量及养分含量测定

土壤含水量采用烘干法测定。土壤pH值采用电极法测定，土水比为 1∶2.5（w/v）。土壤全氮、无机氮、全磷及有效磷含量的具体测定参照美国土壤学会的土壤分析测定方法（Sparks et al.，1996）。土壤全氮含量采用凯氏消煮-靛酚蓝比色法测定。土壤全磷含量采用浓硫酸-高氯酸消煮-钼锑抗比色法测定。使用 2 mol·L-1KCl溶液浸提（w/v=1∶5，180 r，1 h）土壤，采用靛酚蓝比色法测定NH4+-N含量，双波段紫外分光光度法测定NO3--N含量。土壤有效磷含量采用 0.5 mol·L-1NaHCO3（pH=8.5）浸提（w/v=1∶20，180 r，30 min）-钼锑抗比色法测定。土壤有机碳含量采用重铬酸钾氧化-外加热法测定。土壤微生物生物量采用氯仿熏蒸抽提法进行提取（Tian et al.，2008），微生物生物量碳（MBC）含量采用重铬酸钾氧化-外加热法测定，微生物生物量氮（MBN）含量采用茚三酮显色法测定。

表1 调查样区基本情况表Table 1 Basic information of the investigation forests in different slope positions

1.3.2 外生菌根侵染率测定及形态观测

本研究仅针对外生菌根进行了侵染率和形态观测。参照刘润进等（2007）的描述从形态方面对根尖菌根真菌侵染和形态进行了观察，凡是能够观察到根尖明显膨大，有菌丝套覆盖，或有外延菌丝，则表明根尖已经被侵染。将洗净的细根样品置于70%的乙醇中浸泡固定，测定时从中随机取一定量的完整活根在40倍体视显微镜（MOTIC SMZ-140 SERIES）下进行镜检和拍照，分别判断和记录每个视野的根尖总数量及被菌根侵染的根尖数量。整个观察过程，上坡采集了593个视野共1928个根尖，中坡采集了432个视野共1616个根尖，下坡采集了227个视野共1550个根尖。

1.3.3 菌根真菌多样性分析

菌根真菌的多样性采用 PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）法进行分析。将于-80 ℃保存的根系样品采用液氮进行研磨后，利用试剂盒（MOBIO PowerSoil DNA isolation kit）提取与细根共生的菌根真菌总DNA，提取方法按照试剂盒使用说明进行操作。

选用真菌18S rDNA基因特异性引物对GCFung（5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCG CCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG-3′） 和NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）对提取的菌根真菌总 DNA进行 PCR扩增（SCILOGEX TC1000-G，America）。50 μL PCR扩增反应体系为：2 μL Template DNA；1 μL Primer F；1 μL Primer R；25 μL Premix Taq 酶；21 μL ddH2O。扩增反应条件为：94 ℃ 30 s，47 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环。

采用Bio-Rad公司的DcodeTM基因突变检测系统对PCR扩增产物进行DGGE分析。聚丙烯酰胺凝胶浓度为 6%，变性剂浓度梯度范围为 30%－60%。电泳运行条件：1×TAE电泳缓冲液，75 V电压，60 ℃电泳温度，电泳时间16 h。

电泳结束后对凝胶进行银染，采用Bio-Rad全自动紫外凝胶成像系统进行观测并拍照，获得菌根真菌的DGGE条带图谱。使用Quantity One软件（Version 4.5，Bio-Rad，USA）对条带图谱去噪后，确定每个样品的条带数量和每个条带的相对亮度峰值，并计算菌根真菌的群落多样性指数。

1.4 数据统计和分析

菌根侵染率=侵染根尖数／镜检总根尖数×100%。

根据Quantity one软件的测定结果计算菌根真菌基于基因型的群落多样性指数，包括Shannon-Weiner多样性指数（Shannon-Weiner diversity index，H′）、Simpson 指数（Simpson diversity index，D）、丰富度指数（Richness index，S）、Pielou均匀度指数（Pielou evenness index，J）。各指数的计算方式如下：

式中，Pi为第i个DGGE条带出现概率；Ni为第i个DGGE条带的扩增量；N为土壤微生物群落中DNA的DGGE条带扩增总量（N=∑Ni）；S为样品全部真菌种类数（条带数）。

运用Microsoft Excel 2013对各样地的土壤养分指标以及菌根侵染率进行计算、处理和绘图；SPSS 19.0对各指标进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比较（Duncan）；quantity one 软件分析凝胶电泳图谱。

2 结果与分析

2.1 不同坡位土壤特性比较

2.1.1 土壤含水量、pH值及养分含量

不同坡位林地土壤含水量、pH值及养分含量见表 2。不同坡位林分土壤的含水量范围在 25.1%－29.8%之间，随坡位下降略有升高，但差异不显著（P=0.39）。不同坡位林地土壤均呈明显的酸性，pH值范围在 3.8－4.1之间，随着坡位下降略有上升，也不存在显著差异（P=0.14）。不同坡位林地土壤有机碳含量为 23.6－35.2 g·kg-1，随着坡位下降含量升高，其中上坡的有机碳含量显著低于中、下坡（P=0.03）。不同坡位林地土壤全氮和全磷含量变化规律相似，均为上坡＜下坡＜中坡，上坡位土

表2 不同坡位林地土壤理化性质Table 2 Physical and chemical properties of forest soils in different slope positions

壤全氮、全磷含量显著低于中坡位，而下坡位与上、中坡位没有显著差异（P＜0.05）。土壤无机氮含量以中坡最高，达 38.6 mg·kg-1，显著高于上坡和下坡（P=0.01）。各坡位土壤无机氮以硝态氮为主，占 56.7%－75.4%。土壤硝态氮含量以上坡最低（14.3 mg·kg-1），显著低于中坡和下坡（P=0.01）；上坡和中坡的土壤铵态氮含量略高于下坡，但差异不显著（P=0.10）。土壤有效磷含量范围在 8.9－10 mg·kg-1之间，上坡和下坡略高于中坡，差异不显著（P=0.39）。

2.1.2 土壤微生物生物量碳、氮含量

不同坡位林地土壤微生物生物量碳、氮含量变化见图 1。不同坡位林地的土壤微生物生物量碳含量存在差异，以下坡最高，达718 mg·kg-1，显著高于上坡和中坡（P=0.05）。不同坡位土壤微生物生物量氮含量表现为上坡＜中坡＜下坡，在不同坡位间差异不显著，含量在 192.7－229.4 mg·kg-1之间（P=0.17）。上、中、下坡位林地土壤微生物生物量C/N比范围为 2.5－3.1，中坡显著低于上、下坡（P=0.04）。

2.2 菌根真菌的侵染率和形态特征

上、中、下坡林地林木细根的菌根真菌侵染率见图 2。不同坡位间菌根真菌的侵染率差异显著（P=0.04），呈现出从上坡向下坡显著下降的趋势。上坡的菌根真菌侵染率达到92.1%，中坡的菌根真菌侵染率有所下降，为84.7%。而下坡的侵染率最低，仅为74.6%。

不同坡位林分菌根的形态略有差异，但并不明显。上坡林分中的菌根形态多表现为黄色至暗红色（图3A），膨大，光滑，无外延菌丝；部分表现为棕色至黑色，具有外延菌丝（图3B）；还有部分为白色并具疏松菌鞘（图3C）。中坡绝大多数菌根表现为黄色至暗红色，膨大，光滑，无外延菌丝（图3D－F）。下坡与中坡相似（图 3G－I），菌根侵染较少，且形态变化不大，多为簇状。

2.3 菌根真菌的群落多样性

图1 不同坡位林地土壤的微生物生物量碳、氮含量及碳氮比Fig. 1 Microbial biomass carbon and nitrogen content and C/N ratio of forest soils in different slope positions

不同坡位林木菌根真菌的 DGGE电泳图谱及泳道识别图如图4所示，泳道识别图以7号泳道为标准进行分析，泳道条带按照与 7号泳道条带相似度大小排列，百分数越大，条带之间相似性越高，说明它们之间的真菌群落结构相似程度较高。泳道中的条带粗细不一，条带比较粗黑则表示真菌群落密度较大。各个坡位可检测的条带数量为10－20条，其中上坡的条带数量明显高于中、下坡。图中的特异性条带表明不同坡位土壤间菌根真菌群落结构有差异，其中以上坡和中坡的特异性条带较多。

图2 不同坡位林地土壤的菌根真菌侵染率Fig. 2 Mycorrhizal fungal infection ratio of forest soils in different slope positions

基于 DGGE电泳图谱所计算出来的不同坡位林分细根菌根菌群落的多样性指数见表 3。不同坡位菌根真菌群落的 Shannon-Wiener指数（H'）、Simpson指数（D）和丰富度指数（E）差异显著，表现为上坡＞中坡＞下坡（P＜0.05）。而各坡位土壤菌根真菌群落的均匀度指数（J）没有显著差异，整体上随着坡位降低而略有下降。总体而言，上坡的菌根真菌种群具有更加丰富的多样性。

2.4 菌根真菌侵染率、多样性和土壤理化性状的关系

对菌根真菌侵染率及多样性指数与土壤性状进行相关性分析，结果（表 4）表明，不同坡位林地菌根真菌侵染率与土壤有机碳、硝态氮含量呈显著负相关，但与其他土壤养分因子相关性不明显。菌根真菌Shannon-Wiener指数与土壤pH、有机碳含量和硝态氮含量均呈显著负相关，与土壤铵态氮含量呈显著正相关；Simpson指数与土壤有机碳含量呈极显著负相关；丰富度指数与土壤含水量、有机碳含量、有效磷含量和微生物生物量氮含量呈显著负相关。

图3 上、中、下坡林分细根的代表性菌根形态Fig. 3 Representative mycorrhizal morphology of fine roots in upper， middle and lower slopes

图4 不同坡位林分菌根真菌DGGE电泳图谱及泳道识别图Fig. 4 DGGE bands and lane maps of mycorrhizal fungi in different slopes

表3 不同坡位林地土壤菌根菌群落DGGE群落多样性指数Table 3 Diversity indexes of soil mycorrhizal community in different slopes based on DGGE analysis

表4 菌根侵染率、多样性指数与土壤理化性质的相关性Table 4 Correlation of mycorrhizal infection ratio， diversity index and soil physical and chemical properties

此外，从图5可以进一步看出，不同坡位的林地土壤中，随着土壤有机碳含量的增大，菌根真菌的侵染率、Shannon-Wiener指数和丰富度指数均显著地线性下降，其中侵染率和丰富度指数的下降幅度极为明显。而从图6可以看出，土壤硝态氮含量是决定菌根侵染率和菌根真菌 Shannon-Wiener指数的另一重要影响因子，随土壤硝态氮含量的升高，菌根真菌侵染率和Shannon-Wiener指数也均呈现显著的线性下降趋势。另外，菌根真菌的丰富度指数还随着土壤微生物生物量氮含量的增大呈现显著的线性下降（图7）。

3 讨论

本研究通过对亚热带北缘丘陵山区处于不同坡位的天然恢复的次生阔叶林所进行的调查和研究结果表明，坡位对林地土壤的理化特性产生了一定的影响。随着坡位的上升，林地土壤的含水率及pH有所下降，上坡林地土壤的硝态氮、有机质、和全氮含量均显著低于中、下坡位，土壤无机氮和全磷含量也表现为上坡低于下坡，总体上随着坡位的上升，立地条件显著下降。这一结果与前人的研究结果基本一致（侯晓丽等，2013；韦建宏等，2017；张顺平，2014）。不同坡位由于雨水冲刷程度、水分下渗、蒸腾蒸发、温度变化以及养分分解和淋溶等方面的作用和效果不同产生一定的生活因子再分配作用，是造成其土壤水分和养分差异的主要原因（李奕等，2014；薛立等，2011）。本研究区多雨和湿润的气候，雨水长期的冲刷和下渗作用将上坡的许多矿物风化产物、以及凋落物及其分解产物向下坡方向不断淋洗和迁移，此外，由于下坡具有更好的水热条件，凋落物的分解速度更快，因此，下坡具有更好的养分和水分条件。与此相对应，上坡土壤微生物生物量碳的含量显著低于下坡，且土壤微生物生物量氮的含量也随坡位上升呈现减小的趋势。土壤微生物对环境十分敏感，受到气候条件、土壤质地、土壤养分含量等诸多综合因素的影响（成毅等，2010）。但从土壤微生物生物量C/N比来看，本研究林地土壤微生物生物量C/N比在不同坡位并不存在差异，均在3左右，表明该区域次生阔叶林中进行凋落物分解的土壤微生物以细菌占优势，凋落物质量和分解情况总体较好。

图5 菌根真菌侵染率及多样性指数与土壤有机碳含量关系Fig. 5 Relationship between infection ratio and diversity indexes of mycorrhizal fungi with soil organic carbon content

图6 菌根真菌侵染率及Shannon-Wiener多样性指数与土壤硝态氮含量关系Fig. 6 Relationship between infection ratio and Shannon-Wiener index of mycorrhizal fungi with soil nitrate nitrogen content

图7 菌根真菌丰富度指数与土壤MBN含量关系Fig. 7 Relationship between richness index of mycorrhizal fungi with soil microbial biomass nitrogen content

本调查地不同坡位的菌根真菌侵染率与菌根真菌群落多样性变化规律相似，林地上坡菌根侵染率和Shannon-Wiener指数、Simpson指数、丰富度指数均显著大于中坡和下坡。宋福强等（2006）针对亚高山地区森林的研究表明，坡度较小的林地菌根侵染率低于坡度较大的林地。本研究涉及的3个调查林地整体上从上坡往下坡坡度明显减小（表1），在菌根侵染率方面的研究结果与宋福强等（2006）的结果一致。大量的研究表明，物种的数量和分布均匀程度能够比较全面地反映物种的群落分布（刘林馨等，2018）。本研究中，上坡菌根真菌的Shannon-Wiener指数、Simpson指数、丰富度指数最大，与上坡菌根真菌侵染率最高相对应。说明上坡菌根真菌群落最丰富，林木根系受到的侵染程度更高。林木菌根真菌的侵染状况取决于宿主植物和菌根种类的的生物学特性以及土壤因子、水分和温度等综合因素的共同影响（孙婧珏，2012；韦莉莉等，2016；吴勇等，2013）。本研究针对次生阔叶林所进行的研究结果表明，与中、下坡相比，上坡受养分淋溶、冲刷等的影响，林地土壤的有机碳以及氮素相对缺乏，土壤肥力较低，而与之相对应，上坡的菌根真菌侵染率以及真菌的多样性均显著高于中、下坡，说明土壤有机质以及氮素的供应程度的高低在一定程度上可能成为林木与菌根真菌共生的重要诱因。从林木可以直接吸收利用的无机氮组分来看，硝态氮含量总体上与菌根真菌的侵染率以及多样性呈现显著的负相关关系（图 6）。与铵态氮相比，硝态氮在土壤中移动能力强，对林木而言可利用程度更高（陈永亮等，2014；宋海星等，2005）。土壤硝化过程主要受土壤氮矿化水平和铵态氮供应的影响（Reynold et al.，2010；Smiciklas et al.，1992），此外，参与硝化作用的专性微生物对环境有相对较高的要求（Van et al.，2010）。本研究地上坡相对较差的土壤环境以及较低的土壤有机碳、氮含量在一定程度上可能限制了土壤氮的矿化过程以及铵态氮的生成，从而抑制了硝化微生物的活性以及硝化作用；另一方面，雨水的淋洗作用也容易导致土壤硝态氮从上坡向中、下坡的流失，从而导致上坡林木土壤硝态氮的供应显著降低，从而促进了林木与菌根真菌在更大程度上的共生，并相应提高了菌根真菌的多样性，通过多样化的菌根真菌的菌丝扩张增强对养分的吸收能力，维持林木的正常生长。从这一层面看，土壤硝态氮的供应水平可能是决定菌根真菌共生更为重要的因子。

本研究林地土壤微生物生物量氮含量与菌根真菌的丰富度呈现显著的负相关（图 7）。上坡较低的土壤微生物生物量氮含量以及与下坡基本一致的MBC/MBN（图1）进一步表明了上坡土壤氮的缺乏，需要有更多样而丰富的菌根真菌的共生来维持上坡林木的养分需求。此外，上坡较低的土壤MBN含量在一定程度上也表明土壤微生物区系与中、下坡相比在向较低氮素需求的群体转变，这一转变有可能会进一步影响土壤氮素的转化过程和供应，因此，将来还需要针对土壤微生物区系的变化进行相应研究，从而深入全面地把握坡位对立地条件的影响，为次生阔叶林的自然恢复以及生态系统的可持续管理提供进一步的数据支撑。

4 结论

亚热带北缘丘陵山区次生阔叶林天然恢复过程中，坡位对林地土壤的养分含量和分布存在一定影响，并决定了不同坡位林木的菌根侵染特征。上坡土壤有机碳含量、全氮含量以及硝态氮含量显著低于中、下坡，其他养分含量在不同坡位之间差异不显著，但基本上均随坡位上升而下降。土壤微生物生物量碳、氮含量也均以下坡最高，能够有效反映林地地力随坡位的变化。该地区不同坡位的次生阔叶林均存在较高的菌根真菌侵染率（74.6%－92.1%），但与土壤养分和微生物生物量的变化规律相反，上坡的侵染率显著高于中、下坡。菌根真菌的多样性与其侵染率的变化规律相似，Shannon-Wiener指数、Simpson指数和丰富度指数均为上坡大于中、下坡。土壤有机碳、全氮以及硝态氮的含量是该地区次生阔叶林菌根真菌侵染和多样性形成的重要决定性因子。