水解CaCO3作为交联剂制备羧甲基壳聚糖凝胶微球
2019-05-31阚广乾秦荣基盖文龙江晓泽
阚广乾，秦荣基,盖文龙，江晓泽，孙 宾*
(1.东华大学 材料科学与工程学院，上海 201620;2.山东陆海蓝圣生物科技股份有限公司，山东 东营 257500)
羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl Chitosan，简称CMCS，下同)是壳聚糖的羧基化取代产物，其结构是由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖形成的阳离子共聚物，具体如图1所示。CMCS具有良好的生物再生性、生物可降解性、生物稳定性、生物粘附性和无毒等特点，常温下在水溶液中的溶解量最大可达10%质量分数以上[2]。多糖类凝胶微球的研究历史悠久，Bodmeier等人早在1997年就报道使用壳聚糖和三聚磷酸盐反应制备纳米微球，壳聚糖分子链的氨基和TPP发生交联反应，生成结构稳定的纳米微球结构[3]。Shi等人制备了一种由羧甲基壳聚糖、海藻酸钠和胶原复合微球组成的粉状止血剂，在石蜡油和羧甲基壳聚糖水溶液混合，在乳液环境下使用氯化钙作为离子交联剂制备微球[4]。Li等人使用吐温80和乳化剂司班-80/吐温-80为乳化剂，采用反相乳液法，以大豆油为油相，氯化钙为交联剂制得海藻酸钠/壳聚糖纳米微球[5]。银单质的抗菌性能自古代就广泛使用，纳米材料因其尺寸大小而具有特定的量子效应和小尺寸效应使其表面效应十分明显，相比于传统的纯银单质固体，纳米级银单质具有更好的的抗菌效果[6-8]，以生物多糖为载体，制备含银的多糖微球粉末，可用于止血和抗菌材料使用。
凝胶微球的制备采用反相乳液聚合体系，向油相分散相体系中逐滴滴入羧甲基壳聚糖的水溶液，分别使用GDL/碳酸钙和柠檬酸/碳酸钙作为交联体系。通过在溶液中加入硝酸银溶液，使用柠檬酸作为交联剂同时作为银的还原剂，一步法直接制备含银的羧甲基壳聚糖微球粉末，对粉末的银单质和粉末整体的各项其他性能进行表征和测试。
图1 N,O-型羧甲基壳聚糖结构
1 实验部分
1.1 实验原料与试剂
表1 实验原料与试剂
表1(续)
1.2 羧甲基壳聚糖复合凝胶微球制备
1.2.1 GDL/碳酸钙/羧甲基壳聚糖复合凝胶微球的制备
1)称取1 g羧甲基壳聚糖置于100 mL烧杯中，加入24 mL DI-Water充分溶解，制备成质量分数4%的羧甲基壳聚糖溶液，500 r/min下搅拌24 h，真空下脱泡并抽滤；
2)向250 mL三口烧瓶中加入150 mL石蜡油，分别加入2.0 g swan-80和2.0 g tween-80作为乳化剂，加入0.6 g硬脂酸镁促进乳化液的形成，加入0.15 g纳米碳酸钙，机械搅拌2 h混合均匀，转速500 r/min，温度60℃；
3)向体系中加入0.12 g 碳酸钙，搅拌2 h；
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4)使用5 mL注射器抽取4%的羧甲基壳聚糖溶液，逐滴加入羧甲基壳聚糖溶液形成油包水体系；
5)称取0.54 g GDL，于10 mL水中充分溶解，使用滴管缓慢加入三口烧瓶中，搅拌下反应2 h；
6)将溶液转移至分液漏斗，取下层乳白色混合液，3000 r/min下离心1 min；
7)取离心下层固体用石油醚/乙醇分别冲洗三次并再离心，产物减压抽滤除去多余的碳酸钙，40℃下真空干燥。
1.2.2 柠檬酸/碳酸钙/羧甲基壳聚糖微球的制备
1)步骤1-4同1.2.1；
5)称取0.2 g一水柠檬酸，于5 mL水中充分溶解，使用滴管缓慢加入三口烧瓶中，调节温度至95℃，反应2 h；
6)将溶液转移至分液漏斗，取下层乳白色混合液，3000 r/min下离心1 min；
7)取离心下层固体用石油醚/乙醇分别冲洗三次并再离心，产物减压抽滤除去多余的碳酸钙，40℃下真空干燥。
1.2.3 柠檬酸/碳酸钙/AgNPs/羧甲基壳聚糖微球的制备
1)同1.2.1的步骤1、2、3;
4)称取0.1 g AgNO3，溶解于5 mL水中，使用滴管缓慢加入三口烧瓶中；
5)称取0.25 g一水柠檬酸，于5 mL水中充分溶解，使用滴管缓慢加入三口烧瓶中，调节温度至95℃，反应2 h；
6)将溶液转移至分液漏斗，取下层浅黄色混合液，3000 r/min下离心1 min；
7)取离心下层固体用石油醚/乙醇分别冲洗三次并再离心，产物减压抽滤除去多余的碳酸钙，40℃下真空干燥。
图2 凝胶微球的制备过程
Fig.2 Gelation process of CMCS microspheres
2 结果与讨论
2.1 紫外吸收
将粉末样品分散于乙醇溶液中，均匀涂覆在载玻片上，待其自然干燥后粉末粘附在载玻片上，使用固体紫外-可见光分光光度计测试粉末的紫外吸收，设置扫描波长250～750 nm，扫描次数为3次叠加，结果如图3所示。
从图3看出，将使用柠檬酸交联还原的柠檬酸/碳酸钙/AgNPs/羧甲基壳聚糖复合凝胶微球与水溶性纳米银胶束作对比，在固体紫外下，复合凝胶微球的吸收峰峰值出现445 nm处，相比于水溶性银胶束的420 nm略有红移，且峰更宽。说明柠檬酸还原下的银粒径尺寸为纳米级，尺寸应该在20 nm以上，且其还原的纳米银尺寸均一性比水溶性纳米银胶束略差。
图3 水溶性纳米银与含银羧甲基壳聚糖微球的固体紫外
2.2 红外分析
将粉末样品在40℃下干燥除去水分，使用ATR-FT-IR测试红外吸收，波长设置为750～3500，扫描次数为32次。结果如图4所示。
图4 不同凝胶微球的红外
从图4看出，GDL/碳酸钙/羧甲基壳聚糖凝胶微球形成双重交联结构，在未交联的CMCS原料的谱图中，644～934 cm-1处为羧甲基壳聚糖杂环的振动峰，在GDL交联反应后，溶解作用使羧甲基壳聚糖1637 cm-1处由自身氢键作用产生的峰消失，GDL与羧甲基壳聚糖端羧基形成酯键结构，形成1025 cm-1处的酯键峰，1536 cm-1处-NH2移动至1554 cm-1处，由游离胺基结构变成酰胺键II谱带结构；图中1402 cm-1处峰为离子态羧甲基和Ca2+的峰[9]。对比柠檬酸交联的结构，900 cm-1以下的杂环面内面外的振动峰属于羧甲基壳聚糖碳杂环，1368 cm-1，2851 cm-1，2912 cm-1处为柠檬酸碳环结构上C6的面内弯曲和伸缩振动峰，1589 cm-1处为形成的羧酸酯的峰，柠檬酸与羧甲基壳聚糖发生交联反应形成[10]。
2.3 粒度分析
将未分离的离心产物重新溶解分散于100 mL水中稀释，抽取10 mL于100 mL容量瓶中并定容，在常温下，使用纳米粒度与电位仪分析其粒径分布，测试时选用塑料皿，条件为水。
从图5的粒径分布来看，二者均处在微米级，其中，GDL/CaCO3体系的微球粒径在1.8 μm左右，而柠檬酸交联微球的粒径在2 μm以上。从分散性上来看，GDL原位释放钙离子的方法获得凝胶微球的粒径均匀性更好。
1.GDL/碳酸钙/羧甲基壳聚糖复合凝胶微球；2.柠檬酸/碳酸钙/羧甲基壳聚糖复合凝胶微球
图5 粒径分布
Fig.5 Particle size distribution
2.4 热重分析
图6 不同凝胶微球的热失重
通过分析样品的热失重情况，可以看出不同样品的热稳定性的区别，热失重的测试前，将样品在40℃下真空干燥24 h，除去粉末的自由水。将样品在N2氛围下升温到900℃，观察样品的热失重情况。如图6所示。
从图6对比三种羧甲基壳聚糖凝胶微球的热失重情况来看，三条曲线的趋势接近，曲线中，200℃之前的略微下降为结合水的失去，温度200℃之后出现热失重，此为多糖分子链开始断裂时的温度，随着温度的继续升高，当温度到700℃时，多糖分子开始分解。GDL/CaCO3体系交联微球的热稳定性比柠檬酸交联的更好，对比CA/CaCO3/CMCS和CA/CaCO3/AgNPs/CMCS微球，硝酸银的加入和还原成单质银，也略微提高了微球的热稳定性。
2.5 结晶性能
干燥后的产物使用一维X射线衍射仪分析其结晶情况，测试时2θ选5～60°，并计算粉末的总结晶度。如图7所示。
从图7对比纯CMCS和GDL/碳酸钙交联的羧甲基壳聚糖，溶解再成型的过程破坏了羧甲基壳聚糖内部的氢键结构，也使其峰形更加尖锐突出。由于GDL缓慢水解过程消耗掉了全部的碳酸钙，图中不再观察到在30°左右处的隶属于碳酸钙的结晶峰。对比CA/CaCO3/CMCS与纯碳酸钙，为了能够顺利分离微球，所使用的纳米碳酸钙相对过量，因此柠檬酸法制备的含碳酸钙凝胶微球中保留着部分碳酸钙的结晶峰，碳酸钙没有完全溶解，残留在微球粉末中。
图7 不同凝胶微球的XRD图谱
3 总结
分别使用GDL/碳酸钙和柠檬酸/碳酸钙复合体系作为交联剂，制备羧甲基壳聚糖凝胶微球，通过柠檬酸在加热的状态原位还原硝酸银生成纳米银单质，制备含纳米银的羧甲基壳聚糖微球。
(1)使用GDL/碳酸钙体系，在硬脂酸镁作为封端剂的条件下可形成离子交联的微球，微球不水溶，可在乙醇等有机溶剂中均匀分散。
(2)使用柠檬酸/碳酸钙体系，在硬脂酸镁的存在下微球的颗粒较GDL/碳酸钙体系下更大，柠檬酸既可以作为羧甲基壳聚糖的微球的交联剂，同时对硝酸银具有还原作用，生成宽分布的纳米态银单质，使用柠檬酸/硝酸银/碳酸钙还原交联体系可以制备出含银的羧甲基壳聚糖微球，这其中，水相与油相的比例、转速、交联剂的用量对微球的形态都有重要的影响。
