梨火疫病抑菌制剂的室内筛选

2019-05-30梁慧敏王希东杨治月李敬桦

新疆农业科学 2019年2期

梁慧敏，刘君，王希东，杨治月，李敬桦

(1.新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐830052；2.新疆农业大学农学院，乌鲁木齐830052 )

0 引言

【研究意义】梨火疫(Fire blight)是引起梨、苹果等蔷薇科植物发病的最具毁灭性的细菌性病害之一，梨火疫病[1]是我国对外重大检疫性病害之一。在1951～1960 年间，该病害造成美国平均每年因该病经济损失400万美元[2]。该病侵染情况复杂[3]且市场需求种植的品种多为感病品种，目前该病害还没有被有效地控制，防治上较为困难，仍然是大多数梨和苹果种植国主要关注的问题[4]。虽然目前我国还没有梨火疫病发生的报道，但梨火疫病的人为和自然传播已对我国构成了潜在戚胁[5]。仍需严格地做好疫情调查和植物检疫，筛选高效防病药剂，科学防控该病的发生与为害，对我国植物检疫及梨和苹果产业的健康发展具有重要意义。【前人研究进展】自1974年以来，用于防治梨火疫病的化学药剂，主要是抗生素类化合物和铜制剂类，被主要用于在该病害花期防治[4,6]；抗生素链霉素(Streptomycine)在美国被用于防治该病超过50年后，抗链霉素的梨火疫菌株陆续被发现并报道[7-8]。随着侵染生态学及植物病原分子生物学研究的开展，有关于田间拮抗细菌抑制梨枝枯病的报道[9-10]，同时催生出商业化的生防菌类生物制剂，例如Psedomonafluorescens的ASO6菌株已经用于梨火疫病的田间生物防治[11]。【本研究切入点】梨火疫病传入我国的风险很大，且该病害化学防治的研究国内目前尚未见报道，加强对该病害的检疫控制的同时应该要做好防控准备。研究收集针对细菌的各类抑菌制剂，筛选高效抑制该病菌的抑菌制剂。【拟解决的关键问题】以梨火疫模式菌株NCPPB1665为研究对象，通过最低抑制浓度法在抑菌制剂中做初步筛选，通过抑菌实验，筛选出有效抑制梨火疫病菌的防治制剂，为植物检疫防控策略提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

梨火疫菌模式菌株NCPPB1665，由南京农业大学胡白石教授馈赠。

1.1.2 主要试剂

供试抑菌制剂共30种，其中氧化制剂1种、植物源制剂 1种、无机类制剂 5种、抗生素类制剂6种、微生物制剂5种、有机类制剂6种，内吸性制剂6种。表1

表1 供试抑菌制剂
Table 1 List of antibacterial agents and microorganism preparations tested

制剂Bactericides类型Types剂型Dosage forms生产厂家Manufacturers1.8%辛菌胺醋酸盐(1.8%Symplectic bacteria amine acetate)内吸性水剂( AS)西安嘉科农化有限公司20%噻菌铜(20%Thiodiazole-copper)内吸性悬浮剂( SC)浙江龙湾化工有限公司43%戊唑醇 (43%Tebuconazole)内吸性悬浮剂( SC)江苏龙灯化学有限公司50%多菌灵(50% Carbendazim)内吸性可湿性粉剂(WP)江苏蓝丰生物化工股份有限公司20%叶枯唑(20%Bismerthiazol)内吸性可湿性粉剂(WP)安徽省铜陵福成农药有限公司20%三唑酮(20% Triadimefon)内吸性乳油( EC)河北神华药业有限公司3%噻霉酮(3%Benziothiazolinone)有机杂环类微乳剂(ME)江苏辉丰股份有限公司3%噻霉酮(3%Benziothiazolinone)有机杂环类可湿性粉剂(WP)陕西西大华特科技实业有限公司40%噻唑锌(40%Zinc-thiazole)有机锌悬浮剂( SC)浙江新农化工股份有限公司33.5%喹啉铜(33.5%Copper quinolate)有机铜悬浮剂( SC)浙江海正化工股份有限公司12%松脂酸铜(12%Rosin acid copper)有机铜悬浮剂( SC)广东植物龙生物技术股份有限公司30%壬菌铜(30%Nonyl bacteria copper)有机铜微乳剂(ME)西安近代农药科技股份有限公司29%石硫合剂(29%Iime sulphur)无机硫水剂( AS)山东东信生物农药有限和公司70%碱式硫酸铜(70%Basic chrome sulphate)无机铜水分散粒剂(WG)美国仙农有限公司80%波尔多液(80% Bordeaux mixture )无机铜可湿性粉剂(WP)青岛蓝猫化工有限公司46%杜邦可杀得(Dupont kill)无机铜水分散粒剂(WG)上海生农生化制品有限公司6%烯硫酸铜(6%Copper sulfate)无机铜可湿性粉剂(WP)河南倍尔农化有限公司50%春雷王铜(50%Kasumin copper)抗生素、无机铜可湿性粉剂(WP)江门市植保有限公司2%春雷霉素(2%Kasugamycin)抗生素水剂( AS)江门市植保有限公司2%春雷霉素(2%Kasugamycin)抗生素水剂( AS)河北国欣诺农生物技术有限公司8%宁南霉素(8%Ningnanmycin)抗生素水剂( AS)德强生物股份有限公司农用青霉素(Agricultural penicillin)抗生素水剂( AS)中华人民共和国农业部35%多抗霉素B(35%Resistance to doxorubicin)抗生素水剂( AS)郑州意尔达化工有限公司21%过氧乙酸(21% Peroxyacetic acid)氧化杀菌剂水剂( AS)石家庄宝丰化工有限公司80%乙蒜素(80%Ethylicin)植物源杀菌剂乳油( EC)登封市金博士农药化工有限公司多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)微生态制剂水剂( AS)科诺生物有限公司枯草芽孢菌(雨之露) (Bacillus subtilis)微生态制剂可湿性粉剂(WP)建华植保有限公司枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)微生态制剂可湿性粉剂(WP)德强生物股份有限公司荧光假单胞杆菌(Fluorescence pseudomonas)微生物制剂可湿性粉剂(WP)广东真格生物科技有限公司BMC微生物菌剂(BMC microbiological preparation)微生态制剂可湿性粉剂(WP)湖北吾尔力生物工程股份有限公司

1.2 方法

1.2.1 培养基、培养条件及菌悬液的制备

营养琼脂培养基NA：牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，17 g琼脂，加无菌水至1 L，调pH至7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。供试菌在NA固体培养基上28℃恒温过夜培养。用无菌接种环刮下培养好的菌苔转入含无菌水试管中，重悬，根据菌种在600 nm的吸光度值与菌液浓度之间的线性关系(y=0.115ln(x)-1.90[12])用分光光度计调至OD600达0.2，此时菌悬液浓度为108CFU/mL。

1.2.2 筛选抑菌制剂的最低抑制浓度

采用含毒介质-最低抑制浓度法[13]获取

利用梨火疫模式菌株NCPPB1665进行药剂最低抑制浓度的初筛。按照各药剂的使用说明书对每种药剂进行浓度梯度稀释，初试在不同浓度下各药剂的抑菌效果，取6个不同的药剂浓度进行最低抑菌浓度测定，每个浓度至少3个重复。将供试的农药制剂配制成浓度为50 mg/mL的药剂母溶液，待灭菌的营养琼脂培养基温度降至55℃左右时，加入一定体积药液，混合均匀即制备成一定工作浓度的含药剂培养基。用移液器将0.5 μL菌悬液接种于培养基上，每个皿上按三个方位点接种三点，对照用相同体积的菌液接种未加药剂的培养基作对照，重复3次。培养基置于28℃恒温培养箱中培养48 h，观察记录菌落生长情况。

未能辨别出接菌点或有接菌点但干缩的，菌落生长受抑制，以“-”表示；菌点能够生长并保持湿润，以“+”表示。记录每种药剂在每个浓度下菌落不能生长的最低药剂浓度标记为C-，根据式C′=(C++C-)/2，计算实验中的最低抑菌浓度C′，3次实验结果的均值代表该药剂最低抑菌浓度。

1.2.3 抑菌圈法[14]

通过最低抑制浓度法在模式细菌上初筛获得的抑菌制剂，用于抑菌圈实验。具体操作如下：制备NA 培养基平板，将100 μL菌悬液加入皿中并用涂布器涂匀，待菌液干燥后，用移液器吸取8 μL的药剂点在培养皿中央，以加入无菌水的处理作为对照，每个处理重复 3 次，在28℃培养箱中培养12 h后，拍照记录，使用ImageJ软件计算抑菌圈的直径；以药剂浓度的对数为横坐标，抑菌圈的平均直径为纵坐标，用Excel 2019 软件求得各抑菌制剂对细菌的毒力回归方程和相关系数r，并以抑菌圈直径达到一定值(研究以6 mm为基准)时的药剂有效浓度进行毒力比较[15]。

1.3 数据处理

数据使用SPSS 21.0 软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 抑菌制剂对梨火疫模式菌株NCPPB1665的最低抑制浓度筛选

研究表明，在所选的30种市售农药中有17种药剂对菌株NCPPB1665有抑制作用。6种抗生素类型中5种主要以抗生素为有效成分的药剂均无抑制效果；6种内吸性抑菌制剂仅1.8%辛菌胺醋酸盐有作用；6种有机制剂中有5种具有抑制作用；5种无机制剂中有4种具有抑制作用；5种微生物制剂中有4种具有抑制作用，无机铜复配抗生素50%春雷王铜和植物源杀菌剂80%乙蒜素和氧化杀菌剂21%过氧乙酸均对模式菌有抑制作用。有机类、无机类及微生物类制剂是对模式细菌抑制作用较好的3种类型制剂。除列出的抑菌制剂之外的其它制剂在说明书表述的适用浓度范围内对模式菌株未表现出抑制作用。表2

2.2 不同抑菌制剂对梨火疫模式菌株NCPPB1665的毒力测定

研究表明，17种抑菌制剂对梨火疫模式菌株NCPPB1665的毒力作用中，内吸性制剂1.8%辛菌胺醋酸盐相比其他类型药剂有效质量浓度是最低，表明使用同等剂量时该制剂具有较强的抑菌作用；5种有机类制剂中有机杂环类制剂3%噻霉酮(ME)和3%噻霉酮(WP)需要的有效质量浓度都低于有机铜类制剂30%壬菌铜和12%松脂酸铜及有机锌类40%噻唑锌的有效质量浓度，显示使用同等剂量下，噻霉酮具有较强的抑菌作用，壬菌铜的作用次之；4种无机制剂中无机铜类46%杜邦可杀得、80%波尔多液、70%碱式硫酸铜及无机硫类29%石硫合剂均有抑菌作用但使用浓度高、抑菌效果较差；植物源制剂80%乙蒜素、复配药剂50%春雷王铜以及氧化剂型21%过氧乙酸中抑菌效果最好的是80%乙蒜素，其有效质量浓度最低；4种微生物制剂中抑菌效果最后的是荧光假单胞杆菌，相比其它3种微生物制剂所需的实际质量浓度及芽孢个数最少。表3

表2 17种抑菌制剂对梨火疫模式细菌NCPPB1665最低抑菌浓度
Table 2 Minimal inhibitory concentration of 17 antibacterial agents and microorganism preparation to strainErwiniaamylovoraNCPPB1665

药剂种类Bactericide农药有效浓度Concentration(mg/L)ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ最低抑菌浓度Minimal inhibitory concentrationMIC(mg/L)1.8%辛菌胺醋酸盐(1.8%Symplectic bacteria amine acetate)65.144.53.63.27a3b3.143%噻霉酮(3%benziothiazolinone,WP)42.8714.286.664.293.33a3.24b3.380%乙蒜素(80%Ethylicin)120724834.413.6a12.8b13.23%噻霉酮(3%benziothiazolinone,ME)6054.55042.937.5a30b33.7550%春雷王铜(50%kasumin copper)1 000333.5151.59675.5a73.5b74.521%过氧乙酸(21% peroxyacetic acid)840381.78190.89123.4880.85a69.93b74.9770%碱式硫酸铜(70%basic chrome sulphate)777.7499.8350166.6134.4a129.5b130.946%杜邦可杀得(Dupont kill)306.82230209.76191.82164.2a158.7b161.4640%噻唑锌(40%Zinc-thiazole)800571.6444.4400363.6a333.2b34880%波尔多液(80% Bordeaux mixture )800615.2533.6470.4444.8a420.8b432.812%松脂酸铜(12%Rosin acid copper)960720576480a411.48b360523.5630%壬菌铜(30%Nonyl bacteria copper)1 000857.1750666.7600a545.4b572.729%石硫合剂(29%lime sulphur)4 833.33 867.72 9002 521.72 148.1a1 871b2 309.55枯草芽孢杆菌100亿芽孢每克(Bacillus subtilis)1 250333250200161a154b157(1.6×109个/L)BMC微生物菌剂(100亿有效活菌每克)(Microbiological preparation)16 6672 0001 000500323a313b317(3.2×109个/L)荧光假单胞杆菌3000亿芽孢每克(Fluorescent pseudomonas)11 1118 3331 000667556a500b526(1.6×1011个/L)枯草芽孢杆菌(雨之露)1000亿芽孢每克(Bacillus subtilis)1 0002501117156a54b55(5.5×1011个/L)

注： a，表示菌落不能生长的最低药剂浓度 C-；b，表示菌落刚刚能生长的药剂浓度 C+

Note: a,Represent the Minimal inhibitory concentration of the agent that the colony cannot grow C-;b,Represent the concentration of the agent at which the colony is just starting to grow C+

研究表明，不同浓度的参试抑菌制剂均对模式菌株NCPPB1665具有明显的抑菌作用，且其中部分浓度间抑制作用显示极显著差异，并且对17种抑菌制剂间还呈现出整体显著性差异，部分抑菌制剂间差异达极显著。所检测制剂中对梨火疫菌模式菌株NCPPB1665具有较好抑菌作用的是1.8%辛菌胺醋酸盐、3%噻霉酮(ME)、3%噻霉酮(WP)、30%壬菌铜、80%乙蒜素和荧光假单胞杆菌。表3

3 讨论

大部分内吸性类药剂(1.8%辛菌胺醋酸盐除外)及抗生素类药剂对梨火疫菌株几乎没有抑制效果，这些制剂不适用于该病害。根据毒力回归方程，在抑菌圈同等效果之下，(有效用量<10 mg/L)辛菌胺醋酸盐是30种抑菌制剂除微生物制剂外中数据理论得出的最有抑菌作用的抑菌剂。辛菌胺醋酸盐在抑菌方面有相关机理的研究[16]，该制剂在国内防治苹果腐烂病方面[17]和梨根腐病田间防治方面作用明显[18]，且它是一种烷基多胺类环保型、高效广谱、低毒的杀菌剂，该药剂持效期长。

最低抑制浓度实验结果得到的有较好抑菌作用的制剂主要存在于有机类、无机类及微生物类制剂三种类型中。含有噻霉酮的有机制剂是实验数据结果抑菌效果排前的制剂，其最低抑制浓度及抑菌圈的结果均说明，此成分的农药的可湿性粉剂类型效果比微乳剂相对理想，且微乳剂是一种对环境友好的绿色农药制剂，可取代乳油，并且适用于代替可湿性粉剂剂型的农药原药新剂型,在环境友好方面倾向选择微乳剂型[19]，同时有机杂环类噻霉酮的药物机制原理[20]表明该药剂还可以和多种药剂复配，如：噻唑锌，噻菌酮等[21]。

植物源抑菌制剂乙蒜素抑菌效果整体为中上水平，80%乙蒜素是仿生植物源抑菌制剂，系大蒜提取物，低残留，污染小防治效果佳，目前报道可以防治黄瓜细菌性斑病[22]，且该药可以与三唑类抑菌制剂混用，防果树炭疽病、瓜果青枯病等效果能提高40%～75%[23]，也能与壬菌铜进行复配也可提高防治番茄灰霉病的效能[24]。

微生物制剂荧光假单胞杆菌抑菌效果明显优于其它生物制剂。由于菌株能产生多种活性物质，可以抗多种植物病害，如荧光假单胞工程改良菌株对黄瓜枯萎病有更好的防治效果[25-26]；室内实验荧光假单胞杆菌的数据支持了荧光假单胞A5O6菌株适用于梨火疫病的田间生物防治，但是，荧光假单胞菌对病害的防治作用是否还受其它因素限制，如工程菌中转化子本身的稳定性、土壤状况、气候条件等；该菌与植物及病原菌之间的关系是否复杂；不同来源、不同种类、不同生态环境中的菌株对病原菌的作用机制是否一致[27]，成了防治中的潜在问题。因此，防治梨火疫病的药剂筛选还有待进一步田间的深入研究。其次，这次实验中抑菌效果一般的枯草芽孢杆菌在最低浓度试验中100、1 000×108/g剂量最低芽孢亿数明显低于后者，成分相同芽孢杆菌100×108/g单位剂量的相对效果较好。

无机类制剂中无机铜和无机硫，抑菌效果都不理想。铜元素抑菌剂在农业生产中是一类重要的杀菌剂，但随着该类抑菌剂的广泛使用，有些病害如细菌性果斑病已经出现了一些耐铜菌株[28]。无机类制剂在稀释后化合物为解离状态，毒性的阳离子如铜制剂靠释放出铜离子与细菌内物质作用，导致病菌死亡，这类制剂在使用时不宜与其他酸性农药混用且阳离子残留易造成药害。