淫羊藿素通过抑制BACE1阻断APP-PS1-HEK293细胞中淀粉样蛋白生成

张 歆，冯 飞，李园园，巴智胜，黄南渠，罗 勇

(1.遵义医科大学第三附属医院 神经内科，贵州 遵义 563002；2.遵义医科大学第三附属医院 药物临床试验机构办公室，贵州 遵义 563002)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，其特征在于老年人的进行性认知功能和行为障碍。根据国际阿尔茨海默病协会2016年度报告显示，中国约有950万痴呆患者，到2030年可能超过1 600万[1]。由于缺乏有效的治疗药物，AD将成为未来中国面临的主要公共卫生问题。虽然到目前为止尚未充分了解AD的确切病因，但遗传证据已证明淀粉样蛋白-β(Amyloid-β，Aβ)是通过β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(Beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE1)顺序切割淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)而产生的，BACE1在AD的发病机制中起关键作用[2]。作用于BACE1的抑制剂，可能是有AD潜在风险的人的有效预防策略。

淫羊藿素(Icaritin，ICT)，一种来自传统补益中药淫羊藿的异戊二烯类衍生物，分子量为386.4，具有良好的脂溶性，易于通过血脑屏障。研究表明ICT能增强间充质干细胞活力[3]，减弱由Aβ诱导的氧化应激和神经元毒性[4-5]。而天然黄酮类化合物可作为非肽类BACE1抑制剂，有效抑制BACE1活性并降低Aβ的分泌水平。本课题组长期从事ICT治疗AD的研究，采用多种AD模型证实ICT对AD的治疗作用，发现ICT可改善Aβ25-35海马注射的大鼠以及SAMP8快速老化小鼠的学习记忆减退，与其激活AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，抑制BACE1有关[6-7]。但ICT与来自的Merck的verubecestat(或MK-8931)和AstraZeneca的AZD3293(或LY3314814)的BACE1的抑制剂不同[8-10]。ICT作为一种生物活性小分子，对APP代谢具有更广泛的药理学修饰。为了进一步探索ICT对Aβ生成的调控机制，本实验主要探讨ICT对BACE1的调控及其神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 细胞及培养 APP-PS1-HEK293细胞系购自上海酶联生物科技有限公司。APP-PS1-HEK293细胞以DMEM/High培养基(Hyclone，SH30022.01B)[含10%胎牛血清(BI，04-001-1A)，青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL(Hyclone，SV30010)]于37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2 主要试剂 ICT(纯度>98.3%)购自南京泽朗医药科技有限公司；MTT购自合肥新恩源生物技术有限公司；LDH测定试剂盒、DAPI(C1002)购自上海碧云天生物技术有限公司；ECL试剂盒购自赛默飞中国；ELISA测定试剂盒购自R&D中国；BACE1荧光共振能量转移(FRET)测定试剂盒购自美国Panvera；BACE1(ab2077)抗体，PS1抗体(ab76083)，ADAM10抗体(ab1997)，Aβ1-40抗体(ab20068)，GAPDH抗体(ab8245)和山羊抗兔IgG H&L(DyLight 488)购自Abcam中国；辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠或抗兔IgG抗体购自上海Abmart。

1.3 主要仪器 电子天平：上海浦春计量仪器有限公司；BCD-539WT对开门冰箱：中国Haier公司；超净工作台：苏州净化设备厂；细胞培养板：苏州海狸生物医学工程有限公司；XW-80A型漩涡混合器：江苏海门麒麟医用仪器厂；蛋白变性仪、Centrifuge 5417 R冷冻离心机、Research plus手动移液器：德国Eppendorf 公司；Multiskan Go 酶标仪、Forma 3131二氧化碳细胞培养箱：美国Thermo Fisher Scientific公司；荧光倒置显微镜1X73、光学显微镜BX43：日本Olympus公司；-80℃超低温冰箱立式MDF-382E(CN)、SIM-F124制冰机：日本SANYO公司。

1.4 主要方法

1.4.1 IC50测定 根据制造商的说明书使用BACE1 FRET试剂盒进行BACE1酶抑制试验。在DMSO中制备化合物的储备溶液。将样品在测定缓冲液中进一步稀释以制备3×浓度的测试化合物。在黑色的96孔微量培养板的不同孔中，将10 μL BACE1底物(3×浓度)加入10 μL 3×浓度的每种测试化合物中并轻轻混合。然后向每个孔中加入10 μL 3× BACE1酶以开始反应。将平板在黑暗中于25 ℃温育90 min。然后，向每个孔中加入10 μL终止缓冲液(乙酸钠)以终止反应。最后，分别在545 nm和585 nm的激发和发射波长下进行荧光测量。通过将获得的每小时相对荧光单位(RFU/h)与抑制剂浓度的对数作图来计算IC50值。通过非线性回归(曲线拟合)在GraphPad Prism 7中分析测量的抑制数据。

1.4.2 MTT及LDH检测细胞活力及毒性 将用96孔板(5000个/孔)培养的APP-PS1-HEK293细胞用0.1～100 μmol/L的ICT处理16 h。除去培养基，向各孔中加入50 μL含MTT(0.5 mg/mL)的DMEM。将细胞在37 ℃下孵育3 h，加入150 μL DMSO进行溶解，在酶标仪上测量570 nm处的吸光度。根据制造商的方案，在细胞处理后，使用LDH测定试剂盒检测LDH漏出率，在490 nm处测量吸光度。

1.4.3 ELISA测定Aβ1-40用0.5～10 μmol/L的ICT处理APP-PS1-HEK293细胞16 h后，收集培养基和细胞。吸取每瓶细胞的培养基，2 000 r/min离心10 min后取上清用于检测细胞外Aβ1-40；同时每瓶剩下的细胞需加入RIPA裂解液200 μL及PMSF 2 μL冰上裂解30 min，用细胞刮刮下，于4℃离心机里以10 000 r/min离心15 min，收集的上清液用于检测细胞内Aβ1-40。ELISA试剂盒实验步骤均按照试剂盒说明书进行。

1.4.4 免疫荧光测定BACE1 用0.5～10 μmol/L的ICT处理16h后，将盖在盖玻片上的细胞在-20 ℃下用甲醇固定20 min，在室温下用0.1%Triton X-100的PBS处理5 min，用含5%牛血清白蛋白的PBS封闭30 min，然后与BACE1抗体(1∶1 000)在37 ℃温育2 h。经PBS洗涤后，在37 ℃下与缀合有Dylight 488(1∶1 000)的二抗在黑暗中孵育1 h。然后在室温下，在暗处将细胞用DAPI进一步染色2 min并洗涤。然后，使用Olympus BX43F荧光显微镜进行观察。

1.4.5 Western blot测定BACE1、PS1、ADAM10和Aβ1-40的表达 如前所述,培养后制备APP-PS1-HEK293细胞裂解物。在4℃裂解缓冲液处理30 min后，通过在12 000 rpm离心30min除去不溶物质，并使用BCA蛋白质测定试剂盒(Generay，GK5012)测定裂解物的蛋白质浓度。然后通过SDS-PAGE(Beyotime，P0012AC)分离等量(10 μg)的每种样品，转移至PVDF膜(Merck，IPVH00010)。将膜在5%脱脂牛奶的TBST溶液中封闭1 h，TBST洗涤后，在4 ℃下与抗体孵育过夜：BACE1(1∶1 000)，PS1(1∶1 000)，ADAM10(1∶1 000)，Aβ1-40(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)。

用TBST在10min内洗涤膜3次，并与HRP缀合的山羊抗小鼠或抗兔IgG抗体(1∶5 000)一起在室温孵育1h。然后，用TBST洗涤膜3次，并使用ECL试剂盒显现。用Quantity Ones软件(Bio-Rad)定量条带的强度。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0对数据进行统计分析。实验数据以均数±标准误表示，用ONE-WAY ANOVA分析处理，方差齐用LSD法；方差不齐用Dunnett′T3法，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IC50ICT以浓度依赖性方式抑制BACE1的活性，IC50为5.70±1.09 μmol/L(见图1)。

ICT对BACE1的IC50，IC50为5.70±1.09 μmol/L(Mean±SEM,n=3)。图1 用FRET法测定ICT对BACE1活性的影响

2.2 ICT对APP-PS1-HEK293细胞的保护作用 与对照组相比，当ICT浓度为(5～10 μmol/L)时，APP-PS1-HEK293细胞的活力增加(P<0.05)，细胞的LDH漏出率下降(P<0.05)。这些结果表明ICT在浓度为(5～10 μmol/L)时对APP-PS1-HEK293细胞具有保护作用(见图2)。

A：ICT对细胞活力的影响;B：ICT对LDH泄漏率的影响(*:与对照相比P<0.05,Mean±SEM,n=3)。图2 ICT在APP-PS1-HEK293细胞中的保护作用

2.3 ICT对APP-PS1-HEK293细胞内和细胞外Aβ1-40的影响 经过处理后，在APP-PS1-HEK293细胞和培养基中，通过ELISA测量Aβ1-40的含量。我们发现细胞内Aβ1-40含量高于细胞外(P<0.05)，并且通过ICT处理，与对照组相比，Aβ1-40含量降低(P<0.05)(见图3)。

A：Aβ1-40的细胞外浓度;B：细胞内Aβ1-40浓度；*:与对照相比P<0.05,Mean±SEM,n=3。图3 ICT(0.5、5、10 μmol/L)对APP-PS1-HEK293细胞中细胞外和细胞内Aβ1-40的影响

2.4 ICT对APP-PS1-HEK293细胞中BACE1表达的影响 如图4所示，蓝色荧光为DAPI代表细胞核，绿色荧光为BACE1。随着ICT浓度的增加，BACE1荧光强度减少，表明ICT对APP-PS1-HEK293细胞中的BACE1表达具有抑制作用。

蓝色荧光代表APP-PS1-HEK293细胞的细胞核，绿色荧光代表BACE1(比例尺为20 μm)。图4 ICT降低APP-PS1-HEK293细胞中BACE1的表达

2.5 ICT对APP-PS1-HEK293细胞中Aβ形成途径的影响 为了研究Aβ是否真的减少了并且Aβ生成途径是否参与APP-PS1-HEK293细胞中ICT的保护作用，我们检测了Aβ1-40和该途径中涉及的一些蛋白。如图5所示，相对于对照，ICT处理的APP-PS1-HEK293细胞中Aβ1-40表达明显减少(P<0.05)，ADAM10表达增加(P<0.05)，BACE1表达降低(P<0.05)，PS1表达降低(P<0.05)。

A：代表性条带;B：ADAM10的蛋白质水平;C：BACE1的蛋白质水平;D：PS1的蛋白质水平;E：Aβ1-40的蛋白质水平(*:与对照相比P<0.05,Mean±SEM,n = 3)。图5 ICT对APP-PS1-HEK293细胞Aβ形成途径相关蛋白的影响

3 讨论

中医药是我国数千年医药实践的结晶，从传统中医药理论中寻找难治疾病的治疗策略极具潜力。传统中医理论认为肾与脑关系密切，自古便有“肾主骨生髓，脑为髓之海”的理论。中医理论认为脑的功能强健与否主要取决于肾中精气之盈亏[11]。AD为痴呆之症的主要类型，因此，根据中医理论，补肾阳的中药将会是治疗AD的新希望。

淫羊藿(EpimediumL.)是贵州省道地中药材，为小蘗碱科多年生直立草本植物淫羊藿的地上部分，是传统补益类中药之一[12]。因此，基于中医理论可以推断淫羊藿或其有效成分在治疗AD方面具有重要价值[13]。ICT是淫羊藿中提取出的黄酮类有效成分之一，本课题组前期发现ICT可改善Aβ25-35海马注射的大鼠以及SAMP8快速老化小鼠的学习记忆减退，与其激活AMPK，抑制BACE1有关[6-7]。在本实验条件下，类似于其它黄酮类化合物如槲皮素和芹菜素[14]，ICT以浓度依赖性方式抑制BACE1的活性，IC50为5.70±1.09 μmol/L。当ICT(5～10 μmol/L)时，APP-PS1-HEK293细胞的活力增加，LDH漏出率下降，表明ICT在该浓度范围具有保护作用。而与对照组相比，ICT对APP-PS1-HEK293细胞外和细胞内的Aβ1-40均有降低作用。那ICT是如何调控Aβ的呢？

研究表明APP是Aβ的来源，它可被α-分泌酶(ADAM10)、β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶(PS1)分解，其中被BACE1和PS1加工产生Aβ，而被ADAM10加工却被清除[15]。小檗碱可通过抑制BACE1改善3×Tg-AD小鼠的空间学习和记忆功能[16]。很多化合物(维甲酸、没食子酸、隐丹参酮、藁本内酯、白果内酯等)可通过ADAM10刺激非淀粉样蛋白生成途径，促进APP水解，发挥神经保护作用[17]。在本研究中，ICT(5～10 μmol/L)可降低APP-PS1-HEK293细胞的BACE1和PS1蛋白表达，减少Aβ1-40的生成。与此同时，ICT增加了ADAM10的表达，可能发挥了清除APP的作用。并且，在这3个酶中，BACE1的变化最为明显。因此，ICT具有抗Aβ生成的作用，其机制可能主要与其抑制BACE1有关。这不仅为ICT用于治疗AD奠定基础，也为淫羊藿的开发提供新的理论依据。