天麻多糖对小鼠骨骼肌衰老作用的实验研究

王新梅，刘坤祥

(遵义医科大学 人体解剖学教研室，贵州 遵义 563099)

肌肉衰退和萎缩是衰老的重要标志，人体增龄过程至30岁以后每10年肌纤维数量减少5.8%，50岁以后每10年减少12%，80岁以后每10年减少40%[1]，肌纤维数量的减少和力量的降低引起神经和肌肉的协调及平衡紊乱，使老年人容易跌倒并导致骨折[2]，严重威胁老年人的生活质量，探讨衰老过程对骨骼肌的影响及其防治具有重要意义。增龄性骨骼肌衰老亦称骨骼肌减少症(Sarcopenia)，其特征是肌肉质量、肌肉力量和生理功能在生长过程中逐渐减小和衰退[3]。目前骨骼肌减少症的治疗方法主要包括合理膳食与营养、运动训练和药物治疗[4-6]。虽然运动训练疗法的防治作用得到医学界广泛认同，但由于老年人骨骼肌衰弱程度和安全运动量的差异，个性化治疗必不可少。促进蛋白合成的激素类药物因其副作用而逐渐被摒弃，肌肉生长抑制素抑制剂的价值仍在研究中，抗氧化剂对骨骼肌减少症的防治效果也备受关注。天麻多糖(Gastrodia elata polysaccharide，GEP)是天麻的主要活性成分，具有抗衰老、改善学习记忆的作用[6-7]，但在衰老过程中其抗骨骼肌减少的作用及机制未见文献报道。本文拟用D-半乳糖诱导建立衰老小鼠模型，探讨GEP对骨骼肌衰老的影响，并初步探讨作用机制，为运动医学的临床实践提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁级12周龄健康昆明(KM)小鼠50只，雌雄各半，购自重庆医科大学实验动物中心[许可证号：SCXK(渝)：2017-0001]。

1.1.2 主要试剂与材料 天麻多糖粉剂(纯度≥90.0%)购自杨凌慈缘生物技术有限公司，常温保存，使用前用生理盐水配制；D-半乳糖(北京绿泽森生物技术公司)；GSH-Px、CAT、MDA、SOD及8-OHdG试剂盒(MM，上海酶免)；RIPA、PVDF膜、封闭专用脱脂奶粉、 细胞裂解液(北京普利莱基因有限公司)；Trizon Reagent(CWO580S)、BCA蛋白定量试剂盒(CW0014S)(康为世纪公司)；Caspase-3、MAFbX、MURF-1、GAPDH一抗及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(中杉金桥公司)。

1.1.3 主要仪器 UV-1600PC紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；DYY-6C蛋白垂直电泳仪(北京市六一仪器厂)；倒置荧光显微镜(Leica)；TGL-16G低温高速离心机(常州中捷实验仪器制造有限公司)；CFX ConnectTM实时荧光PCR仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司)；HH-2数显恒温水浴锅(郑州宏朗仪器设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药 适应性喂养1周后，随机分为5组，每组10只(雌雄各半)：对照组(control)、模型组(model)和天麻多糖低(low)、中(medium)、高(high)剂量组。天麻多糖低、中、高剂量组与衰老模型组小鼠每天皮下注射5%D-半乳糖(125 mg/kg)造模，对照组以相同方式注射等体积生理盐水，连续给药8周。从造模第10天开始，低、中、高剂量组分别给予0.4、2.0、10.0 mg/(g·d-1)天麻多糖灌胃，连续7周，对照组与衰老模型组以等体积的生理盐水替代。普通饲料喂养，自由饮水，环境温度20-24℃，实验结束颈椎脱臼处死，取材用于后续检测。

1.2.2 小鼠一般情况观察 每周观察小鼠精神、自主活动、毛发色泽及每周末检测小鼠体重变化；每个月末用握力试验检测小鼠肌肉力量：先让小鼠前肢抓住水平绳子，观察出现后肢抓绳爬行所需的时间；测算腓肠肌、股四头肌、肝、肾的脏器系数(脏器系数(%)=脏器湿重/体重)。

1.2.3 肌组织病理学检测 取0.5 cm×0.5 cm腓肠肌组织4%多聚甲醛固定6 h，梯度酒精脱水，石蜡包埋，作3～5 μm横切片，HE染色，高倍镜下观察拍照，每张切片选取5个视野，Image Pro Plus 5.0软件测量肌纤维横截面积。

1.2.4 ELISA检测氧化应激相关指标 称取40 mg腓肠肌组织充分匀浆，2 000 rpm离心20 min，收集上清液，按ELISA 检测试剂盒说明书操作流程，450 nm波长测定吸光度值，以标准物浓度与OD值绘制标准曲线，检测计算腓肠肌组织SOD、CAT、GSH-Px、MDA及8-OHdG含量。

1.2.5 qRT-PCR检测Caspase-3、MAFbX、MuRF-1的mRNA表达 取腓肠肌组织，液氮研磨，13 400 rpm离心20 min后取上清，加入Trizol试剂提取总RNA，以OD260/280确定RNA纯度，按试剂盒说明逆转录成cDNA，Real-time PCR扩增Caspase-3、MAFbX、MURF-1和GAPDH基因。反应体系50μL，反应条件：95 ℃ 5 min 、95 ℃ 30 s 、59 ℃ 30 s 、72 ℃ 30 s、40个循环，用2-ΔΔCt计算各基因的mRNA相对表达量，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成，序列(见表1)。

表1引物序列

基因引物序列(5′-3′)扩增长度(bp)MuRF-1上游GTGCCAACGACATCTTCCAG158下游TTCCACCAGCAGGTTCCTCTMAFbX上游CAGCAGCCTGAACTACGACG174下游GAGAAGTCCAGTCTGTTGAAAGCCaspase-3上游TGGACGCAGCCAACCTCAGAG382下游GCATACAGGAAGTCAGCCTCGAPDH 上游AAGAAGGTGGTGAAGCAGG111下游GAAGGTGGAAGAGTGGGAGT

1.2.6 Western blot检测Caspase-3、MAFbX、MuRF-1mRNA蛋白水平 提取0.2g腓肠肌组织的总蛋白，按BCA法进行蛋白定量。上样进行凝胶电泳，转膜，用3%脱脂奶粉室温封闭，加入1抗稀释液，孵育3 h，洗膜3次后加入2抗稀释液(1∶5 000稀释)，孵育2 h，洗涤，ECL试剂显影，应用软件分析蛋白质条带的灰度值，以目的蛋白与内参照GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对水平。

2 结果

2.1 一般情况变化 与对照组相比，模型组小鼠出现明显脱毛现象，毛发色泽变黄，活动度明显下降，天麻多糖干预的各组小鼠上述情况有明显改善。与模型组相比，天麻多糖干预的各组小鼠体重增加明显，且呈剂量依赖性(见图1)。

图1 各组小鼠体重变化

2.2 肌力、脏器系数及肌组织病理变化 与对照组相比，模型组小鼠1个月末和2个月末后肢开始抓绳爬行的时间明显延长，但随着天麻多糖灌胃给药，小鼠抓绳攀爬的时间缩短，高剂量组小鼠肌力接近0 month时水平(见图2)；天麻多糖有助于维持恒定的脏器系数，延缓衰老(见图3)。与对照组相比，模型组的肌纤维横截面积明显缩小，而给予低、中、高剂量天麻多糖后，肌纤维横截面积增加至接近对照组水平(见图4)。

**：与0 MONTH比较，P<0.01。图2 各组小鼠四肢肌力的变化

*：与对照组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05。图3 各组小鼠的脏器系数变化

A：对照组；B：模型组；C：GEP低剂量组；D：GEP中剂量组；E：GEP高剂量组；* ：与对照组比较，P<0.05；#：与衰老模型组比较，P<0.05。图4 各组小鼠腓肠肌横截面积变化(×400)

2.3 GEP对小鼠氧化应激水平的影响 与对照组相比，模型组出现SOD、CAT、GSH-Px降低而MDA、8-OHdG增加，表明本实验成功构建了小鼠衰老模型，而GEP干预的各组显示上述指标变化出现反转，差异有统计学意义(见图5)，体现出GEP具有延缓小鼠骨骼肌衰老的作用。

*：与对照组比较， P<0.05；#：与衰老模型组比较，P<0.05。图5 腓肠肌SOD、CAT、GSH-Px、MDA、8-OHdG活性及含量

2.4 骨骼肌Caspase-3、MAFbx和MuRF-1 mRNA表达变化 与对照组相比，模型组Caspase-3、MAFbX和MuRF-1的mRNA相对表达量显著升高。随着GEP剂量的增加，Caspase-3、mMAFbX和MuRF-1的mRNA相对表达量逐渐下降至接近对照组水平(见图6)。

与对照组相比，*：P<0.05；与模型组相比,#：P<0.05。图6 腓肠肌Caspase-3、MAFbX和MuRF-1 mRNA表达

2.5 骨骼肌 Caspase-3、MAFbX和MuRF-1蛋白水平变化 与对照组相比，模型组Caspase-3、MAFbX和MuRF-1蛋白水平显著上调。随着GEP剂量的增加，上述Caspase-3、MAFbX和MuRF-1蛋白水平逐渐下降(见图7)。

*：与对照组比较，P<0.01；#：与模型组比较，P<0.01。图7 腓肠肌MuRF-1、MAFbX和Caspase-3蛋白水平

3 讨论

衰老是增龄过程中出现的全身器官功能退变，而骨骼肌减少是衰老过程在骨骼肌组织的具体体现，其发病率高且严重影响老年人的日常活动和生活质量。衰老的自由基学说认为衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的，而天麻多糖具有抗衰老、清除氧自由基等生物学作用。因此本研究旨在探讨天麻多糖对骨骼肌衰老的作用及机制初探。由于增龄性衰老过程的时程较长，本研究选择目前国内外普遍采用的D-半乳糖诱导建立衰老动物模型，具有接近自然衰老过程且经济、耗时短、安全的特点。本实验经皮下注射5%D-半乳糖(125mg/kg)造模8周，模型组小鼠出现明显四肢肌肉力量下降，HE染色骨骼肌纤维横截面积明显减小及氧化应激指标的改变提示已成功建立D-半乳糖诱导骨骼肌衰老小鼠模型。

已有研究结果报道体重、肌肉力量及脏器系数可间接反映机体的衰老程度，而氧化应激与衰老也存在密不可分的关系，SOD和MDA在活性氧代谢中发生主要作用[8]。本研究发现，模型组SOD活性及GSH-Px、 CAT水平较对照组明显下降，而MDA含量、8-OHdG明显升高。给予天麻多糖干预可以反转上述指标变化，同时小鼠的体重、肌肉力量及脏器系数较模型组有明显改善。进一步证实骨骼肌衰老过程存在氧化应激增强，并由此导致骨骼肌的损伤，并提示天麻多糖可降低骨骼肌衰老过程中的氧化应激及其对骨骼肌损伤，进而延缓其衰老。

骨骼肌是人体的蛋白质库，衰老过程中的骨骼肌减少实质是蛋白质合成和降解的失衡，导致肌肉功能减退[9-10]。泛素蛋白酶系统是骨骼肌蛋白质降解过程中的主要途径，泛素连接酶(E3)是该途径的关键酶。泛素连接酶(E3)中的肌肉环指蛋白-1(MuRF-1)和肌肉降解因子(MAFbX)，是泛素蛋白酶系统在肌肉降解中的重要组成部分[11-12]。另一方面骨骼肌萎缩与细胞凋亡密切相关，骨骼肌是一种富含线粒体的组织，产生的氧自由基(ROS)可直接损伤DNA并诱导细胞凋亡，Caspase家族相关蛋白的激活是引起凋亡的直接效应物[13-14]，Caspase-3是细胞凋亡的执行者。故本研究选择从骨骼肌蛋白降解途径的关键酶((MuRF-1、MAFbX)和肌细胞凋亡途径相关因子(Caspase-3)为对象，进一步探讨天麻多糖延缓骨骼肌衰老可能机制。结果显示，与对照组相比，模型组小鼠腓肠肌MAFbX、MuRF-1及Caspase-3的mRNA表达和蛋白水平上调；给予天麻多糖干预后， MAFbX、MuRF-1及Caspase-3的mRNA表达和蛋白水平逐步恢复。由此推测，天麻多糖对骨骼肌细胞凋亡途径及泛素蛋白酶途径有一定的调控作用。

综上所述，D-半乳糖可诱导小鼠产生衰老模型，天麻多糖干预可缓解此模型的小鼠骨骼肌衰老，其作用机制可能与下调氧化应激水平、抑制细胞凋亡和抑制泛素蛋白酶系统有关。