铜镉联合胁迫处理对鲫体内重金属和组织病理的影响

涂叶绿 沙小梅 庞娟娟 刘 俊 邵艳红 王振兴 李 鑫

(1. 江西师范大学地理与环境学院, 南昌 330022; 2. 江西师范大学国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心, 南昌 330022;3. 江西省淡水鱼高值化利用工程技术研究中心, 南昌 330022)

重金属污染是指由重金属或其化合物造成的环境污染, 近年来已成为全球性的环境问题[1]。重金属污染主要因为工业上废水、废渣和废气的排放, 农业上化肥、杀虫剂等的使用, 以及生活污水的排放和废弃物的堆放等, 对环境造成严重的影响[2]。重金属污染一部分表现在土壤中, 给土壤生态系统带来不利影响[3,4]; 另一部分则表现在水体中, 对水生生物的健康产生危害, 进而以食物链的形式传递到人体, 对人体健康产生威胁[5—7]。

铜(Cu)和镉(Cd)是常见的重金属污染物, 对鱼类的生理活动有重要影响[8]。对于鱼类而言, 铜是其新陈代谢所需的元素之一, 但浓度过高后将在鱼体富集进而对其造成较大程度的损害, 增加鳃的渗透压和氧化应激, 影响其神经系统等[9,10]。镉是一种非典型过渡性金属, 对于生物而言是非必需金属,能够对鱼类的个体发育、成活率等产生不利影响,引起肝脏等组织器官发生病变[11]。水体环境中的重金属铜和镉不仅能在鱼体内富集, 而且会对鱼体各组织产生病理损伤, 影响其健康生长。单丹等[12]研究表明, 罗非鱼的各组织均能富集铜, 但不同组织对铜的富集能力不同, 其中肝脏组织的富集量最高。Guardiola等[13]研究了水体中不同镉浓度和暴露时间对金头鲷体内镉富集程度和组织病理变化的影响。目前, 在铜和镉对鱼体的影响方面, 主要研究集中在两方面: 一是检测多种重金属元素(含铜和镉)在鱼体内的富集情况及食用安全性[14,15];二是通过暴露实验模拟研究铜或镉对鱼体毒性效应、组织病理学等方面的影响[16,17]。人为进行铜镉联合胁迫对鱼体影响的相关报道较少。Jiang等[18]研究了单一的和联合的铜镉对鲤热休克蛋白的影响, Driessnack等[19]研究了水体铜和镉对黑头呆鱼各组织重金属富集和繁殖能力的影响, 赵岩[20]研究了铜、镉和铬对孔雀鱼的单一与联合毒性效应。目前, 尚未发现有关铜镉水体联合暴露对鲫各组织重金属蓄积和病理影响的系统报道。以鲫为对象,研究联合胁迫处理下铜镉在其体内的富集及对机体各组织病理的影响, 能反映铜镉对鲫生长健康状况的影响, 对我国鲫的食用安全性评估有着重要的意义。

鲫(Carassius auratus), 是我国重要的食用经济鱼类之一, 属于我国大宗淡水鱼范畴, 其产量位居淡水鱼前列。据统计, 2016年, 我国鲫年产量在各淡水鱼品种中位居第5, 达3×109kg, 比2015年增长3.19%[21]。鲫肉质鲜美, 营养丰富, 深受广大消费者的欢迎和喜爱[22]。课题组前期以鲫为对象, 分别研究了铜和镉对鲫各组织蓄积情况和组织病理的影响, 发现铜和镉均能在鲫体内富集并对机体各组织产生病理损伤。

因此, 基于当前研究现状和前期研究基础, 本文以鲫为研究对象, 采用实验室模拟半静态法, 人为添加铜和镉在水体环境中, 研究联合胁迫下铜和镉在鲫体内的蓄积情况, 进一步通过组织病理学研究铜镉联合胁迫对鲫组织器官的影响, 为综合研究铜镉污染对鲫健康状况的影响提供理论参考和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用鲫为异育银鲫, 源于江西省南昌市某养殖场; 铜标准品和镉标准品来自于国家标准物质研究中心; 鱼饲料, 购自通威股份有限公司南昌分公司; 五水合硫酸铜和氯化镉均为分析纯, 分别购自西陇化工股份有限公司和天津市大茂化学试剂厂。

1.2 方法

铜镉联合胁迫处理鲫用半静态水体暴露法, 将鲫在曝气3d的清水中驯养14d。在驯养期间,每天喂食2次, 每次投放饲料量为鱼体重的1%。在驯养结束后, 调整水体的Cu2+浓度分别为0、0.01、0.05、0.10和0.15 mg/L, Cd2+浓度依次为0、0.05、0.10、0.15和0.20 mg/L。为避免因鱼体吸收导致水体重金属浓度下降, 每天更换三分之一的重金属溶液并采用虹吸法除去异育银鲫的代谢产物和杂余饵料。Cu和Cd联合胁迫处理14d后将鲫解剖, 取出肝脏、鳃丝、肌肉和肠道, 置于-80℃冰箱备用。

鲫中铜和镉含量的检测参照涂宗财等[23],采用混合酸(HNO3∶HClO4=9∶1)消解样品, 加热除去剩余的混合酸、定容后, 用原子吸收光谱法检测铜和镉含量。

鲫的组织病理研究病理检测参考郑婷婷等[24], 将样品固定在4%的多聚甲醛中24h, 常规梯度乙醇脱水, 石蜡包埋, 采用病理切片机(RM2016型, 上海徕卡仪器)进行切片, 石蜡切片厚4 μm,HE染色, 中性树胶封片, 显微镜(Nikon Eclipse CI,日本尼康)观察并放大200倍拍照记录。

2 结果

2.1 重金属铜镉在鲫体内的富集分析

图1为重金属铜镉联合胁迫处理14d后鲫肝脏、鳃丝、肠道和肌肉中铜、镉含量分布图。与对照组(未添加铜、镉)相比, 铜镉联合胁迫能显著提高鲫肝脏、鳃丝、肠道和肌肉中铜和镉的含量,表明鲫各组织器官均能富集水体环境中的重金属铜和镉。

在铜镉联合胁迫下, 随着水体环境中镉含量的增加(从0.05 增加至0.20 mg/L), 鲫肝脏、鳃丝、肠道和肌肉中镉的含量呈上升趋势。其中, 鳃丝对镉的富集效果最为明显, 当高浓度铜镉联合胁迫处理鲫14d后, 其鳃丝中镉含量达到了0.42 mg/kg。与鲫体内镉含量的变化趋势相反, 随着水体环境中铜含量的增加(从0.01 增加至0.15 mg/L), 鲫肝脏、鳃丝、肠道和肌肉中重金属铜的含量整体呈现下降的趋势。

2.2 在铜镉联合胁迫下鲫肝脏的组织病理变化

如图2所示, 未添加铜镉的空白组鲫肝脏组织切片见图2a, 肝细胞呈多角状, 细胞界限清晰, 结构完整, 排列紧密, 细胞质染色较浅, 细胞核染色较深且基本位于细胞中央位置。在0.01 mg/L铜和0.05 mg/L镉联合胁迫处理鲫后, 其肝细胞界限仍然清晰可见, 结构较为完整, 但观察到了血细胞聚集现象(图2b)。当铜镉浓度分别增加到0.05和0.10 mg/L时, 部分肝细胞已被损伤, 肝脏组织中聚集的血细胞明显增多, 还出现了脂沉积(图2c)。当铜镉浓度分别达到0.10和0.15 mg/L时, 鲫肝脏组织不仅表现出血细胞聚合和脂沉积, 而且部分肝细胞呈现了空泡化现象(图2d)。在0.15 mg/L铜和0.20 mg/L镉联合胁迫处理鲫后, 鲫肝细胞形状不规则且大小不一,血细胞聚集和脂沉积已随处可见。此外, 细胞空泡化程度明显增强, 表明鲫肝细胞已受到严重损伤。

2.3 在铜镉联合胁迫下鲫鳃丝的组织病理变化

图1 铜镉联合胁迫处理后鲫不同组织中铜、镉的含量Fig. 1 The concentrations of Cu and Cd in different tissues after combined treatment

图2 铜镉联合胁迫处理后鲫肝脏的病理图Fig. 2 Liver histopathology of Carassius auratus after combined treatment with Cu and Cd

如图3所示, 未胁迫处理的鲫, 其鳃丝结构清晰完整, 鳃小片长短均一、排列整齐(图3a)。在0.01 mg/L铜和0.05 mg/L镉联合胁迫处理鲫后, 鲫鳃丝结构清晰可见, 然而鳃小片基部上皮细胞轻微增生, 黏膜肿胀(图3b)。当铜镉浓度增加到0.05和0.10 mg/L后, 鲫鳃小片上皮细胞增生明显加重, 并伴随着充血的症状(图3c)。当水环境中铜镉浓度分别为0.10和0.15 mg/L时, 鳃组织出现鳃小片上皮细胞水肿、增生、黏膜肿胀等症状, 甚至部分鳃小片已难以辨识(图3d)。当铜镉浓度进一步提高, 分别达到0.15和0.20 mg/L时, 鳃丝组织除上皮细胞水肿、增生之外, 还表现出鳃小片结构消失、脱落溶解的症状(图3e)。

图3 铜镉联合胁迫处理后鲫鳃丝的病理图Fig. 3 Gill histopathology of Carassius auratus after combined treatment with Cu and Cd

图4 铜镉联合胁迫处理后鲫肠道的病理图Fig. 4 Gut histopathology of Carassius auratus after combined treatment with Cu and Cd

2.4 在铜镉联合胁迫下鲫肠道的组织病理变化

如图4所示, 未胁迫处理的鲫, 其肠道组织未见明显的病理损伤, 肠道绒毛形态完整, 肠上皮细胞排列整齐(图4a)。在0.01 mg/L铜和0.05 mg/L镉联合胁迫处理鲫后, 肠道组织虽结构清晰完整, 但杯状细胞出现了肿胀现象(图4b)。而在0.05 mg/L铜和0.10 mg/L镉联合胁迫处理鲫后, 其肠道组织杯状细胞肿胀明显加重, 固有层出现液泡, 柱状细胞增生(图4c)。当水环境中铜镉浓度分别达到0.10和0.15 mg/L后, 观察到鲫肠道组织不仅出现固有层液泡, 而且伴随有肠黏膜糜烂、肠绒毛断裂等现象(图4d)。当水环境中铜镉浓度分别为0.15和0.20 mg/L时, 鲫肠道组织结构较为模糊, 柱状细胞增生显著,固有层出现液泡, 肠黏膜糜烂, 且肠绒毛脱落坏死(图4e)。

2.5 在铜镉联合胁迫下鲫肌肉的组织病理变化

从图5a可以看出, 未胁迫处理的鲫, 其肌纤维呈多边形, 结构完整有序。然而, 在0.01 mg/L铜和0.05 mg/L镉联合胁迫处理鲫后, 其肌纤维的结构遭到破坏, 出现弯曲、断裂的现象(图5b)。增加铜镉浓度分别到0.05和0.10 mg/L, 此时鲫的肌纤维已明显断裂, 且纤维间隙变宽(图5c)。铜镉浓度继续增加到0.10和0.15 mg/L后, 鲫的肌纤维断裂, 肌肉细胞聚集, 同时纤维间隙宽度增大(图5d)。当水环境中铜镉浓度分别达到0.15和0.20 mg/L时, 鲫的肌纤维断裂、肌肉细胞聚集, 还呈现出肌纤维溶解崩溃的症状(图5e)。

3 讨论

3.1 重金属铜镉在鲫体内的富集及食用安全性

鲫肌肉重金属含量是判断其食用安全性的重要评价指标, 我国行业标准《NY 5073-2006 无公害食品水产品中有毒有害物质限量》中明确规定鱼类含镉量不能超过0.10 mg/kg[25]。在本文的铜镉联合胁迫实验中, 铜浓度设置为0.01—0.15 mg/L,镉浓度设定为0.05—0.20 mg/L。当0.15 mg/L铜联合0.20 mg/L镉胁迫处理鲫14d后, 其肌肉中镉含量达到了0.13 mg/kg, 超过了我国的行业标准阈值。但鲫肌肉中铜含量最大值为3.23 mg/kg, 远小于标准中鱼类铜含量(≤ 50 mg/kg)的限定。此外, 本文中鲫生存的水环境中铜浓度(0.01—0.15 mg/L)低于镉浓度(0.05—0.20 mg/L), 但在鲫的肝脏、鳃丝、肠道和肌肉中, 铜含量显著高于镉, 即铜在鲫体内的蓄积效果比镉明显。原因可能是, 铜在生物体内作为独特的催化剂, 不仅参与造血过程中铜和铁的代谢, 还参与一些酶和黑色素的合成[26]。因此, 必需元素铜比非必需元素镉更易于鱼体主动吸收, 继而在鲫各组织中富集程度更高。

图5 铜镉联合胁迫处理后鲫肌肉的病理图Fig. 5 Muscle histopathology of Carassius auratus after combined treatment with Cu and Cd

3.2 重金属铜镉对鲫各部位组织病理的影响

在铜镉联合胁迫下, 随着水体环境中铜含量的增加, 鲫各部位(肝脏、鳃丝、肠道和肌肉)中铜的含量整体呈下降趋势, 可能是因为鱼体同时对铜和镉进行富集, 镉抑制了机体对铜的吸收, 这与吴东军等[27]的报道相似, 镉可以抑制鱼类胃和肠对铜和锌的吸收。在鲫的各部位中, 肝脏对铜的富集效果最明显, 当0.01 mg/L铜联合0.05 mg/L镉胁迫处理鲫14d后, 其肝脏中铜含量达到了4.95 mg/kg。这与马莉芳[9]的研究结果一致, 其研究结果表明, 在黄河鲤的各组织中, 肝脏对铜的蓄积效果最为显著。肝脏既是动物体的解毒器官, 又能够通过抗氧化系统酶活力的诱导实施自我保护, 借助相关代谢酶活性的抑制而使代谢物积累在肝脏[23,28—31]。

肝脏具有解毒和防御功能, 是鱼类维持生命活动和代谢的实质性组织器官[23,29,30]。在一般情况下, 水环境中的重金属(如铜、镉等)由鳃丝摄入鱼体, 再经血液循环达到肝脏等器官, 当积累的重金属浓度超出肝脏的解毒能力, 将会损伤肝细胞、影响其微观结构[32—34]。在本文中, 铜镉联合胁迫处理鲫后, 其肝组织出现了血细胞聚集、脂沉积、细胞空化等症状, 说明铜镉联合处理损伤了鲫的肝组织。此外, 除重金属之外, 其他污染物亦会对鲫的肝组织产生不良影响。课题组前期研究表明, 水体中的磺胺嘧啶对鲫的肝脏组织具有较强的毒害作用, 致使其发生不同程度的病理变化, 其中包括肝细胞淤血、空泡化、核固缩、细胞溶解坏死等[24]。

鳃是鱼类的呼吸器官, 在呼吸过程中与外界水环境直接接触, 容易受水环境中污染物的影响, 造成鰓组织的病理损伤[24]。在本文中, 铜镉联合胁迫对鲫鰓组织的影响主要表现为上皮细胞增生、水肿、黏膜肿胀, 以及鳃小片脱落溶解等。污染物影响和损伤鱼鳃组织形态变化的反应有两种: 一种是防御反应, 即使得鱼鳃产生炎症, 表现出上皮细胞肿大、鳃小片隆起等; 另一种是污染物直接损伤,表现出上皮细胞坏死脱落, 鳃结构破坏等[24,35,36]。基于本文中铜镉联合胁迫对鲫鰓组织造成的损伤现象, 推测低浓度的铜镉联合胁迫引起了鲫鰓组织的防御反应, 而后期高浓度的铜镉联合胁迫则给鲫鰓组织造成了直接损伤, 出现了鳃小片脱落、溶解等现象。

肠道是鱼类对营养物质消化和吸收的重要场所, 肠道组织发生病变易影响营养物的消化吸收,造成鱼类营养不良、生产滞缓[24]。同时, 作为鱼类的重要免疫器官之一, 肠道的损伤易增加其患病风险[37]。在本文中, 铜镉联合胁迫处理鲫使其肠道杯状细胞肿胀、柱状细胞增生、固有层出现液泡、肠黏膜糜烂、肠绒毛脱落坏死等, 表明铜镉损伤了鲫的肠道组织, 对吸收营养物质和抵御外界环境造成不利影响。肠道的健康状态也可通过肠道微生态的变化来反映。课题组前期结果表明, 水体污染物(包括抗生素、重金属等)会改变鲫肠道微生物组成, 降低鲫肠道微生物的多样性, 对鲫的健康有着较大威胁[24,38]。

鲫肌肉不仅能供人类食用以补充蛋白质, 而且对鱼体自身而言还承担着运动功能。因此, 鲫肌肉组织的病变损伤一方面会影响其食用品质和安全性, 另一方面将降低鲫的运动能力和生存本领。在本文中, 铜镉联合胁迫处理鲫能导致其肌纤维断裂、聚集、崩溃、溶解, 同时伴随着肌纤维间隙变宽, 实验结果也表明鲫肌肉组织遭到严重损伤, 影响其生长和食用特性。除重金属之外, 其他水体污染物也会对鱼类的肌肉组织造成不良影响。郑婷婷等[24]研究显示磺胺嘧啶会促使鲫肌肉组织发生病变, 主要表现为肌纤维排列疏松、紊乱和断裂。此外, 陈秀荣等[39]研究结果表明, 氰戊菊酯会损伤草鱼肌肉组织, 使草鱼肌纤维排列紊乱和松散, 且表现出明显的运动不协调性。

铜和镉均能在鱼体内富集, 并对鱼体各组织产生病理损伤[40]。任洪涛等[41]研究了Cr6+对草鱼肝脏组织结构的影响, 结果表明, Cr6+使得草鱼肝细胞肥大, 无序性离散程度增大, 细胞核缩小, 出现细胞空化等现象。聂志娟等[42]研究发现, 高浓度的铜能对刀鲚幼鱼鳃造成严重损伤, 使其上皮细胞肿大、毛细管充血、鳃小片脱落。在本文中, 随着水体中铜镉浓度的增加, 鲫各组织(肝脏、鳃丝、肠道和肌肉)中镉含量呈上升趋势, 铜含量呈下降趋势, 且各组织病理损伤程度明显加重。镉进入鱼体内, 在肝脏与硫蛋白结合生成络合物, 影响机体对铜的吸收[27], 使得机体各组织中铜含量下降。因此, 有理由推测, 铜镉联合胁迫处理鲫过程中, 镉在鲫各组织病理损伤中发挥了主导作用。这与本文中铜镉对鲫食用安全性的影响结果相一致。随着水体中铜和镉含量的增加, 鲫肌肉中的镉含量超出了食用标准的阈值, 而铜含量始终在安全食用范围内。

综上所述, 本文研究了水体中铜镉联合胁迫对鲫各组织(肝脏、鳃丝、肠道和肌肉)铜镉的蓄积能力及其病理的影响。水体中的铜和镉均能在鲫各组织中富集, 随着水体中铜和镉浓度的增加, 鱼体各组织铜镉含量呈相反趋势, 即铜含量下降、镉含量上升, 主要原因是重金属镉抑制了鲫对铜的吸收。当水体中铜和镉浓度分别为0.15 和0.20 mg/L,联合胁迫处理鲫14d后, 其肌肉中镉含量超出了行业标准的阈值。铜镉联合胁迫处理鲫后, 其各组织均受到不同程度的病理损伤, 且铜镉浓度越高、损伤程度越大, 主要是由于机体内镉浓度的升高所导致。上述结果表明, 在自然环境中, 尤其是铜镉含量较高的水域, 需特别关注镉对鲫的生长健康状况和食用安全性带来的不利影响。