负压封闭引流技术干预兔骨骼肌缺血再灌注损伤后炎性反应的实验研究

陈驾君，杨 帆，解 杰，王 翔，高 伟，白祥军

(华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科，武汉 430030)

挤压伤及挤压综合征是创伤救治中的常见伤，救治效果不佳，具有极高的病死率[1]。其主要危害机制为解除压迫后的骨骼肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，I/R)，这种序贯性的损伤可导致失控性炎性反应，继而出现全身炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、脓毒症和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[2]。缺血再灌注损伤发生和发展是挤压综合征中的重要环节，如何在源头上控制炎性反应，减轻毒素回吸收对机体造成的危害，成为临床研究的重点目标之一。本院创伤外科利用负压封闭引流(vacuum sealing drainage，VSD)技术在临床上治疗挤压伤取得了良好效果[3]，但是该技术通过对损伤骨骼肌的局部作用，减轻缺血再灌注损伤和继发全身炎性反应的具体机制尚不明确。因此，笔者通过缺血再灌注损伤动物模型模拟挤压伤，结合前期兔创面模型的相关实验基础[4-7]，来探讨VSD技术在挤压伤时对炎症因子、炎症细胞和炎性反应的干预作用，以阐明其在减轻骨骼肌缺血再灌注损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性新西兰白兔30只，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，体质量2～3 kg，实验前适应性饲养1周。本实验所涉及的实验动物饲养与科学操作均符合《实验动物管理条例》。

1.2动物模型的建立 将新西兰白兔按照150 mg/kg的剂量，从耳缘静脉注射盐酸氯胺酮注射液，麻醉成功后固定于操作台。缺血再灌注损伤模型制备：将白兔左后腿中部以上的皮肤剃毛、消毒后剪开，于大腿根部游离股动、静脉并予以保护，大腿中上水平切断所有肌肉及神经，将离断的肌肉进行原位缝合，使左下肢成为仅通过股动、静脉及骨骼与肢体连接的组织块；使用无创伤血管夹阻断股动、静脉造成下肢缺血(持续4 h)，然后放开血管夹，造成再灌注损伤(持续6 h)。

1.3实验分组及干预 将30只实验兔分为3组，即对照组、缺血再灌注组(I/R组)、VSD干预的缺血再灌注组(I/R+VSD组)，每组10只：(1)对照组动物仅完成组织游离，不进行左下肢静脉的夹闭及开放；(2)I/R组动物完成组织游离后进行左下肢静脉的夹闭及开放，不进行VSD干预；(3)I/R+VSD组的动物在进行再灌注的同时对损伤处予以VSD干预。术中VSD负压控制在-125 mm Hg(-16.6 kpa)，各组实验结束后将兔用空气栓塞法处死，取相应部位组织进行生化指标测定和组织学分析，对外周静脉血进行生化指标测定。

1.4仪器与试剂 (1)仪器：便携式负压吸引仪(武汉维斯第公司)、Cell-PYN Sapphire全自动血细胞分析仪(美国Abbott公司)。(2)材料：VSD一次性负压引流护创材料(武汉维斯第公司)、特制饲养笼(武汉同济医院实验动物中心)。(3)试剂：①酶联免疫吸附试验(ELISA)TNF-α和IL-6检测试剂盒(北京博奥森公司)、PGE2检测试剂盒(美国Ebioscience公司)、C5a检测试剂盒(上海科顺公司)、CRP检测试剂盒(美国Dade Behring公司)；②免疫组织化学法(IHC)小鼠CD11b试剂盒(上海宾智公司)、羊抗小鼠IgG(上海研生公司)；③蛋白免疫印迹法(Western blot)：小鼠hs-CRP试剂盒(上海研生公司)。

表1 各组家兔骨骼肌组织中各生化指标的表达情况

*：P<0.05；**：P<0.01，与对照组比较；Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01，与I/R组比较；-：无数据

1.5样本取材和检测方法 (1)炎症因子组织标本：各组实验结束后，将兔处死，使用冰去离子水对获取的兔左下肢骨骼肌组织进行冲洗并进行匀浆处理，使用低温离心机以3 000 r/min离心10 min，取上清液以ELISA法进行TNF-α、IL-6、PGE2和C5a的检测，严格按照试剂盒说明操作。(2)炎症标志物组织标本：本实验引入GAPDH蛋白作为内参，采用免疫印迹法检测hs-CRP蛋白的表达。取漂洗干净的骨骼肌组织，提取总蛋白进行15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并转移至硝酸纤维素膜上，封闭过夜后依次加入鼠抗兔hs-CRP一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG二抗，使用化学发光法进行显色。(3)炎症细胞组织标本：同上，采用IHC法检测组织内多形核中性白细胞(PMN)特异性标记物CD11b的表达。(4)炎症因子血液标本：各组实验结束后，将兔处死前，于兔耳缘静脉抽取外周静脉血1 mL，使用低温离心机以3 000 r/min离心5 min，取上清液以ELISA法进行TNF-α和IL-6的检测，严格按照试剂盒说明操作。(5)炎症标志物血液标本：同上采用ELISA法，检测兔外周静脉血中CRP水平。(6)炎症细胞血液标本：同上抽取静脉血1 mL注入血常规试管，低温保存，60 min内送往华中科技大学同济医院检验科，应用Cell-PYN Sapphire全自动血细胞分析仪自动进行WBC计数。

2 结 果

2.1骨骼肌组织中炎症因子水平的变化 在建模过程中，I/R组和VSD组各有1只白兔死亡。与对照组比较，I/R组TNF-α、IL-6、PGE2和C5a水平均显著增高(t=5.157，P<0.01)，I/R+VSD组TNF-α和C5a水平显著增高(t=2.373，P=0.035)；与I/R组比较，I/R+VSD组的TNF-α、IL-6、PGE2和C5a均显著降低(t=4.699，P<0.01)，见表1。

2.2骨骼肌组织中炎症标志物水平的变化 免疫印迹法检测结果显示，对照组、I/R组和I/R+VSD组hs-CRP蛋白相对灰度比分别为0.738±0.467，2.341±0.773和1.299±0.391。统计学分析结果显示，3组相对表达量差异具有统计学意义(F=45.453，P<0.01)，见图1。

*：P<0.05；**：P<0.01，与对照组比较；Δ：P<0.05，与I/R组比较

图1 骨骼肌组织中炎症标志物水平的变化

*：P<0.05；**：P<0.01，与对照组比较；Δ：P<0.05，与I/R组比较；-：无数据

图2 骨骼肌组织中炎症细胞数量的变化

2.3骨骼肌组织中炎症细胞数量的变化 免疫组化法检测及图像分析结果显示，对照组、I/R组和I/R+VSD组PMN特异性标记物CD11b表达分别为113±58，362±101和252±87。统计学分析结果显示，3组PMN细胞数差异具有统计学意义(F=26.448，P<0.01)，见图2。

表2 各组家兔静脉血中各生化指标的表达情况

*：P<0.05；**：P<0.01，与对照组比较；Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01，与I/R组比较；-：无数据

2.4外周静脉血中炎症因子、炎症标志物水平和炎症细胞数量的变化 与对照组比较，I/R组TNF-α、IL-6、CRP水平和WBC数量显著增高(t=9.247，P<0.01)，I/R+VSD组TNF-α、IL-6和CRP水平显著增高(t=4.754，P<0.01)；与I/R组比较，I/R+VSD组的TNF-α、IL-6、CRP水平和WBC数量显著降低(t=7.415，P<0.01)，见表2。

3 讨 论

临床上挤压伤起病急骤，在机械力和再灌注损伤的双重机制可迅速出现全身失控性炎性反应，同时常伴有急性肾功能不全，继发各种器官功能损害，病死率较高，所以挤压伤和挤压综合征是临床上治疗的重点和难点。挤压综合征发病机制主要为肌肉等组织受到机械力作用，直接损伤和缺血引起的变性、坏死及解除挤压后再灌注损伤导致的自溶[8]。有时，即使挤压时间不长，没有造成严重的器质性损伤，也会由于解除挤压后，组织内自由基释放、细胞内钙超载和横纹肌坏死溶解，导致严重的炎性反应和不可逆的损伤。其中，骨骼肌是受缺血再灌注损伤最为敏感的机体组织[9]，缺血骨骼肌的细胞在恢复供血后的最初几分钟内即可发生再灌注损伤，裂解后诱导释放各种炎症因子，并经过静脉回流，造成炎症因子的全身播散和级联反应。因此骨骼肌也是挤压伤后缺血再灌注损伤预防和治疗的研究重点。

VSD技术是近十年来新兴的一种创面物理治疗技术[10]，可明显预防和改善创面感染，加快创面愈合，已广泛应用于各种急慢性创面的治疗中[11]。同时，国内外的临床研究均表明[12-13]，应用VSD技术可有效改善挤压伤和挤压综合征造成的危害，但是具体作用机制仍存在争议。

适当的炎性反应可以将细胞因子水平维持在适当的水平，有利于细胞免疫和机体恢复；如果炎性因子过度释放和调节失控，则会诱发全身炎症反应综合征(SIRS)，继发多器官功能障碍综合征(MODS)。笔者推测，在缺血再灌注损伤中，VSD技术利用其负压抽吸作用，可以有效去除组织内积聚的有害物质[14]，减少炎症因子释放及炎症细胞的进一步趋化，下调炎性反应，从而减轻挤压伤后再灌注损伤引起的一系列严重后果，预防MODS的发生。在炎性反应中，最为重要的炎症因子是TNF-α、IL-6、PGE2和C5a，分别具有启动炎性反应、活化炎症因子、引起血管通透性增高和趋化炎症细胞的作用。TNF-α是参与创伤后机体炎性反应的主要细胞因子之一[15]。IL-6则可由多种细胞合成和释放，通过刺激血小板活化因子协同TNF-α放大炎性反应[16]。PGE2是花生四烯酸环氧合酶代谢产物，是前列腺素的一种，其作用为扩张血管，升高血管通透性，利于炎症细胞进出血管壁[17]。C5a是存在于血清与组织液中的一种经活化后具有酶活性的蛋白质。活化后，高浓度的C5a是中性粒细胞、单核细胞等炎症细胞的趋化剂，可刺激这些细胞沿着浓度定向移动致损伤部位发挥炎性反应[18]。WBC是一种非特异性免疫的直接效应细胞，活化的WBC还可以通过释放炎症因子、增加血管通透性、产生趋化作用等参加局部的炎性反应。除非发生免疫抑制，WBC的增高是全身炎症水平最为基础的评判指标，而PMN是白细胞中主要的效应细胞[19]。CRP则主要是在IL-6等细胞因子调节下，主要由肝脏合成分泌的一种蛋白质，也可由炎症局部的巨噬细胞少量产生。CRP以糖蛋白的形式存在于血液中，能增强白细胞的吞噬能力、增强淋巴细胞活性、激活补体等作用。CRP是急性时相蛋白(acute phase protein，APP)中变化最敏感的一种，而hs-CRP则是目前评价炎症最为敏感的指标之一[20]。因此，减少创伤处的局部炎症因子，是阻断缺血再灌注损的源头，预防全身失控性炎性反应和继发MODS的重要途径之一。

通过本实验可证实，VSD技术不仅可明显下调再灌注损伤后兔骨骼肌局部的炎症因子(TNF-α、IL-6、PGE2和C5a)的生成和表达，同时减少局部骨骼肌炎症细胞(PMN)的浸润，降低局部炎性反应；继而减少炎症因子(TNF-α和IL-6)进入外周循环，改善全身炎性反应，避免失控性炎性反应的发生，从而最终预防MODS。

综上所述，本实验通过VSD技术，减少兔骨骼肌缺血再灌注损伤模型中炎症因子的表达，控制炎症细胞趋化，可有效下调局部和全身的炎症水平。结合笔者之前的实验数据[3-4,21]，为其用于治疗挤压伤-挤压综合征-缺血再灌注损伤提供了理论依据。