HPLC同时测定六味葛蓝降脂片中葛根素、大豆苷元、橙黄决明素和大黄酚的含量

肖明 周雅琪 李芳婵

[摘要] 目的 建立高效液相色谱法同时测定六味葛蓝降脂片中的葛根素、大豆苷元、橙黄决明素及大黄酚的含量。 方法 采用高效液相色谱法，色谱柱Phenomenex Gemini C18（250 nm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，检测波长为285 nm，柱温30℃，流速1.0 mL/min。 结果 葛根素、大豆苷元、橙黄决明素及大黄酚进样量分别在0.01 458～0.06 562 mg/mL、0.1074～0.2417 mg/mL、0.014 58～0.065 62 mg/mL、0.012 01～0.054 04 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系（r = 0.995 94、0.999 95、0.999 97、0.991 57）；平均加样回收率分别为99.0%、102.9%、104.1%、104.1%，RSD分别为0.390%、0.910%、0.050%、0.057%（n = 6）。 结论 本方法简便、准确，方法稳定性、重复性良好，可用于六味葛蓝降脂片的质量控制。

[关键词] 高效液相色谱；六味葛蓝降脂片；葛根素；大豆苷元；橙黄决明素；大黄酚

[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（c）-0105-05

Simultaneous determination of puerarin， daidzein， aurantio-obtusin and chrysophanol in Liuwei Gelan Jiangzhi Tablets by HPLC

XIAO Ming1 ZHOU Yaqi2 LI Fangchan3 JIANG Lin3 WEI Bowei2

1.Health Food Branch of Guangxi Zhuang Yao Pharmaceutical Engineering Technology Research Center， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530023， China； 2.Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China； 3.School of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of puerarin， daidzein， aurantio-obtusin and chrysophanol in Liuwei Gelan Jiangzhi Tablets. Methods High performance liquid chromatography method was used. Phenomenex Gemini C18 （250 nm × 4.6 mm， 5 um） was used as the chromatographic column. The mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution. The gradient elution method was used. The detection wavelength was 285 nm， the column temperature was 30℃， and the flow rate was 1.0 mL/min. Results The injection quantities of puerarin， daidzein， aurantio-obtusin and chrysophanol showed good linear relationship with peak area in the range of 0.014 58-0.065 62 mg/mL， 0.1074-0.2417 mg/mL， 0.014 58-0.065 62 mg/mL， 0.012 01-0.054 04 mg/mL （r = 0.995 94， 0.999 95， 0.999 97， 0.991 57）， respectively， and the average recovery rates were 99.0%， 102.9%， 104.1%， 104.1%， and RSD were 0.390%， 0.910%， 0.050%， 0.057% （n = 6）， respectively. Conclusion The method is simple， accurate， stable and reproducible. It can be used for the quality control of Liuwei Gelan Jiangzhi Tablets.

[Key words] High performance liquid chromatography； Liuwei Gelan Jiangzhi Tablets； Puerarin； Daidzein； Aurantio-obtusin； Chrysophanol

近年来，高脂血症发病率呈明显增高和年轻化的趋势，在饮食控制的基础上使用保健食品调整血脂水平，对防治心脑血管疾病具有重要意义[1-4]。六味葛蓝降脂片是由广西中医药大学制药厂开发的具有辅助降血脂功效的产品，其由绞股蓝、火麻仁、决明子、葛根、沙棘和荷叶六味药食同源药材配伍而成。原标准仅以单指标成分进行质量控制，难以控制中药复方的整体质量[5]。方中主药决明子和葛根具有降血脂和改善心脑血管循环等作用[6-8]。其中决明子的降血脂代表性成分有大黄酚和橙黄决明素[9-11]。葛根降血脂的代表性成分有葛根素、大豆苷元[12-15]。本研究采用高效液相色谱法对六味葛蓝降脂片中橙黄决明素、大黄酚、葛根素和大豆苷元4种药效成分进行含量测定，建立控制指标，以期为全面考察六味葛蓝降脂片內在质量提供科学依据。

1仪器与试药

1.1 仪器

Agilent-1260高效液相色谱仪、Alltech1260-UV型紫外检测器、KQ5200型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、TGL-16G离心机（上海安亭科学仪器厂）、SQP型电子天平[百万分之一，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.2 试药

葛根素对照品（上海融禾医药科技有限公司，批号：170109，纯度为>98%）、大豆苷元对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-17101202，纯度为99.99%）、橙黄决明素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111900-201303，纯度为99.1%）、大黄酚对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-17041310，纯度为99.50%）。甲醇、乙醇、磷酸（分析纯）、乙腈（色谱纯）。

六味葛蓝降脂片样品（规格：2 g/片，批号：20170501、20170601、20170602、20170603、20170701、20170801、20170802、20170803、20170901、20171001）均由广西中医药大学制药厂提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Phenomenex Gemini C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）；按表1进行梯度洗脱，流速：1 mL/min；检测波长：286 nm；柱温：30℃；进样量：15 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品制备 精密称取葛根素、大豆苷元、橙黄决明素及大黄酚对照品适量，以甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为葛根素1.027 mg/mL、大豆苷元1.030 mg/mL、橙黄决明素1.045 mg/mL及大黄酚1.102 mg/mL的混合对照储备液；另取上述溶液适量，置于同一量瓶中，加甲醇制成含葛根素、大豆苷元、橙黄决明素及大黄酚浓度分别为0.1535、0.03413、0.05104、0.04203 mg/mL混合对照品溶液，避光冷藏保存。

2.2.2 供试品溶液制备 取重量差异项下的六味葛蓝降脂片20片，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20 mL，超声（功率200 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷，摇匀，过滤，挥干，用适量95%乙醇溶解并定容置5 mL容量瓶，摇匀，过滤，离心半径8 cm，13 000 r/min离心10 min，取滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液制备 按六味葛蓝降脂片处方比例称取缺葛根和决明子的药材，分别按处方工艺提取，再按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，即得。

2.3专属性试验

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，对照品色谱中与样品色谱在相同保留时间处都有色谱峰，而阴性対照液中无相应峰，提示样品中其他成分对葛根素、大豆苷元、橙黄决明素及大黄酚成分的测定无干扰，理论塔板数均>5000，拖尾因子均在0.95～1.05，分离度均>1.5。见图1。

2.4 线性关系考察

精密取上述混合对照品溶液适量，分别配成葛根素浓度为0.043 87、0.087 74、0.1316、0.1535、0.1755、0.1974 mg/mL，大豆苷元浓度为0.009 750、0.019 50、0.024 38、0.034 13、0.039 01、0.043 88 mg/mL，橙黄决明素浓度为0.014 58、0.029 17、0.043 75、0.058 33、0.065 62 mg/mL，大黄酚浓度为0.012 01、0.024 02、0.036 03、0.042 03、0.048 04、0.054 04 mg/mL的溶液；按“2.1”项下色谱条件分别进样测定。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。结果见表2。

2.5 中间精密度试验

取上述混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，分别测定葛根素、大豆苷元、橙黄决明素及大黄酚的峰面积，其RSD分别为1.30%、0.99%、0.99%、0.66%。提示仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

取六味葛蓝降脂片样品（批号：20170801）适量，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算RSD。葛根素、大豆苷元、橙黄决明素及大黄酚的RSD分别为1.90%、0.52%、1.80%和2.10%。提示供试品溶液中的4个成分在室温下24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取六味葛蓝降脂片样品（批号：20170801），平行6份，按“2.2.2”項下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算。结果6份样品中葛根素、大豆苷元、橙黄决明素及大黄酚的平均含量分别为0.7975 mg/g、0.1608 mg/g、0.2342 mg/g、0.1721 mg/g，RSD分别为3.7%、2.5%、2.9%、3.1%。提示本法重复性较好。

2.8加样回收率

取同一批含量已知的六味葛蓝降脂片样品（批号：20170801）粉末6份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入葛根素、大豆苷元、橙黄决明素、大黄酚对照品0.3260、0.0724、0.0996、0.0860 mg，按“2.2.2”项下供试品溶液制备，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果葛根素、大豆苷元、橙黄决明素、大黄酚的平均加样回收率分别为99.0%、102.9%、104.1%、104.1%。提示该方法准确性较好。见表3。

2.9 样品含量测定

取10批六味葛蓝降脂片样品粉未，平行3份，按照“2.2.2”项下供试品制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算葛根素、大豆苷元、橙黄决明素和大黄酚的含量。综合原药材来源差异，拟制订葛根素、大豆苷元、橙黄决明素、大黄酚含量限度分别不少于0.8702、0.1920、0.2938、0.2188 mg/片。见表4。

3 讨论

10批六味葛蓝降脂片中葛根素、大豆苷元、橙黄决明素及大黄酚的含量均存在一定差异。通过分析，认为可能是由于不同批次六味葛蓝降脂片的原药材产地不同，其成分含量不同所致。为更好地控制该制剂含量，应从药材源头开始，并在整个生产过程中严格进行质量控制，才能更好地保证制剂的质量。本研究建立的高效液相色谱法可同时测定制剂中多个不同指标成分，该方法简单快速、准确可靠，重复性及稳定性均较好。与原标准[5]比较，具有分离效果好、简单快速的测定多种成分的优点，可作为该制剂的质量控制方法。决明子和葛根为六味葛蓝降脂片中辅助降血脂功效的重要组成，决明子中的大黄酚和橙黄决明素为降血脂的主要活性成分，可以作为六味葛蓝降脂片的质量标志物之一[16-17]。葛根中的葛根素能降低血清总胆固醇，调节胆固醇血症患者的血脂水平，是葛根降血脂的重要活性成分[18-19]。大豆苷元对心血管具有保护作用，可以作为产品质量控制指标[20-21]。本研究选择葛根素、大豆苷元、橙黄决明素及大黄酚4种成分作为指标成分对六味葛蓝降脂片进行质量控制，为六味葛蓝降脂片的研制与开发提供了理论依据。

[参考文献]

[1] 农毅清.药食两用中药降血脂活性成分的研究概况[J].广西中医药，2016，39（1）：4-7.

[2] 食品市场资讯.美、日心血管类保健食品现状与发展趋势[J].中国食品学报，2007，7（4）：119.

[3] 杨勇，阚健全，赵国华，等.血管内皮功能与调节心血管功能保健食品的功能评价[J].食品科学，2004，25（8）：173-176.

[4] 钱勇.保健食品领跑降脂降糖产品市场[N].医药导报，2006，3（C19）：1-2.

[5] 农毅清，蒋林，罗宇东，等.六味葛蓝降脂片质量标准研究[J].食品与药品，2016，18（3）：170-174.

[6] 何菊英，刘松青，彭永富，等.决明子降血脂作用机制研究[J].中国药房，2003，14（4）：10-12.

[7] 赵淑芹.葛根的药理作用与临床应用[J].中国医药科学，2013，3（2）：40-43.

[8] 王青，张伟东，宋小妹，等.HPLC法同时测定不同产地决明子中12种蒽醌类成分的含量[J].解放军药学学报，2012，28（6）：502-505.

[9] 冯艳平.决明子降血脂有效成分探讨[J].中国医药指南，2013，11（5）：258-259.

[10] 黄小平，钟国跃，张雪梅，等.HPLC法测定决明子中大黄酚和橙黄决明素[J].中国中药杂志，2010，35（16）：2065-2067.

[11] 崔苏镇，彭学莲.葛根的药理作用研究概况[J].时珍国医国药，1998，9（3）：90-91.

[12] Song W，Li Y，Qiao X，et al. Chemistry of the Chinese herbal medicine Puerariae Radix（Ge-Gen）：A review [J]. Chin Pharm Sci，2014，23（6）：347-360.

[13] 姚丹，丁选胜.葛根素药理作用机制探讨及临床应用[J].中国临床药理学与治疗学，2008，13（4）：468-474.

[14] 尹丽红，李艳枫，孟繁琳，等.葛根的化学成分、药理作用和临床应用[J].黑龙江医药，2010，23（3）：371-373.

[15] 郑高利.大豆异黄酮的药理作用Ⅰ[J].中国现代应用药学，1998，15（1）：4-5.

[16] 何菊英，刘松青，彭永富，等.决明子降血脂作用机制研究[J].中国药房，2003，14（4）：10-12.

[17] 李明元，罗孟军，叶娉，等.橙黄决明素的降血脂作用研究[J].中药药理与临床，2008，24（6）：36-37.

[18] 沈奇桂，朱寿民.决明子对实验性高胆固醇血症和动脉粥样硬化的抑制作用及其机理探讨[J].浙江医科大学学报，1993，22（6）：246-249.

[19] 石勇，吳正奇.葛根和葛根保健品的国内外研究进展[J].湖北工学院学报，2000，15（1）：52-55.

[20] 李和伟，赵彤，董玲，等.口服葛根的肠代谢特征分析[J].国际中医中药杂志，2014，36（2）：131-134.

[21] Choo MK，Park EK，Yoon HK，et al. Antithrombotic and antiallergic activities of daidzein，a metabolite of puerarin and daidzin produced by human intestinal microflora [J]. Biol Pharm Bull，2002，25（10）：1328.

（收稿日期：2018-05-30 本文编辑：王 蕾）