海洛因对大鼠额叶、海马区泛素蛋白酶体功能的影响

【摘 要】目的：观察海洛因对大鼠额叶和海马区脑组织形态学改变及Ub、UbE1在脑组织中的表达，探讨海洛因对中枢神经系统功能和形态的影响及其发生机制。方法：选择SD大鼠，分为3组（短时组2w、长时组4w及正常对照组），首日每次皮下注射海洛因3mg/kg，每天2次，逐日按3mg/kg递增海洛因注射量，连续9天（第9天每次剂量达27mg/kg），第10天用5.0mg/kg纳洛酮腹腔注射，诱发戒断症状，对海洛因成瘾大鼠模型戒断症状进行评分；对照组按同样方式注射等量生理盐水。采用免疫组织化学方法分别检测Ub、UbE1在神经元中的表达变化。结果：Ub和UbE1主要表达在神经元细胞核、细胞质内，细胞外未见表达。图像分析显示Ub、UbE1的表达量均为海洛因长时依赖组（4w）<海洛因短时依赖组（2w）<非海洛因依赖组，差别具有统计学意义（P<0.05）。结论：海洛因中毒可引起脑组织形态学改变，表现为神经元数量减少、神经元变性等，其机制可能与泛素蛋白酶体功能障碍有关。

【关键词】海洛因；大鼠额叶；中枢神经系统；泛素-蛋白酶体系统

海洛因（heroin），化学名为二醋吗啡，是成瘾性极强的吗啡衍生物。大量人群流行病学、动物实验研究结果均表明[1，2，3]，海洛因依赖可导致广泛神经元变性坏死、萎缩退化及脱髓鞘改变；临床上大多有智能减退， 表现为计算力、理解力、定向力、记忆力、判断力减退， 甚至痴呆。因此，近年来认为海洛因依赖也属于一种与记忆、痴呆症相关的慢性、复发性神经变性疾病[4]。

泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）是机体修复或消除异常蛋白质的重要途径，在神经变性疾病中发挥着重要作用。近几年来，随着UPS的分子机制研究取得的巨大的进展，UPS在神经变性疾病的发病机制中的作用也得到了许多研究的肯定。UPS功能的缺陷，无论是UPS水平的过高还是过低，都可能导致神经变性疾病的发生。国内外对于海洛因成瘾及复吸所引起的神经损害是否也受UPS的调控尚未见报道。本文通过建立海洛因依赖大鼠模型，研究Ub、UbE1在大鼠额叶、海马区表达水平的变化，探讨海洛因致脑损伤机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD大鼠30只，购自贵州医科大学实验动物中心。3月龄，体重200-220g，雌雄各半。

1.2 药品和试剂

海洛因由贵州省公安厅提供。泛素（Rabbit Anti-Ubiquitin）、泛素激活酶（Ubiquitin-activating enzymel， UbE1）购自北京博奥森公司；生物素化二抗（山羊抗兔IgG）购自北京博奥森公司，其余试剂为国产分析纯。

1.3 动物模型

经过适应性喂养一周后，按体重及性别随机分为3组，每组10只，长时组（皮下注射海洛因4w），短时组（皮下注射海洛因2w），正常对照组（皮下注射等量生理盐水），饲养期分别为2周和4周，参照以往文献成功复制海洛因依赖模型的方法[5]，给予SD大鼠海洛因皮下注射，首日每次剂量3mg/kg，每天2次，逐日按3mg/kg递增海洛因注射量，连续9天（第9天每次剂量达27mg/kg）。对照组按同样方式注射等量生理盐水。每天观察动物生长发育状况及体重变化情况。第10天用5.0 mg/kg纳洛酮腹腔注射，诱发戒断症状观察30min，对海洛因成瘾大鼠模型戒断症状进行评分，确认海洛因依赖模型成功。短时组继续皮下注射27mg/kg海洛因4天（共计2周），每天2次；长时组继续皮下注射27mg/kg海洛因18天（共计4周），每天2次。生理盐水对照组各5只大鼠分别采用与模型组相同剂量的生理盐水注射2周、4周。

1.4 动物行为变化观察

观察大鼠毛色、饮食、活动情况、精神状态，用电子秤称量大鼠体重。参照Seebers等评分标准，进行大鼠催促戒断症状评分。

1.5 取材和标本制备

各组大鼠分别用戊巴比妥腹腔注射麻醉，灌注4%的甲醛溶液固定，参照鼠脑立体定位图谱冠状取海马区、前额叶皮质组织（包含周边组织）。

1.6 HE染色和尼氏染色

多聚甲醛固定，石蜡包埋组织连续切片，片厚4μm，取海马、前额叶皮质脑组织切片，进行常规HE染色，参照周君[6]的方法进行尼氏染色，略有改动。

1.7 免疫组织化学Envision法

切片常规脱蜡至水，0.01mol/L枸缘酸钠缓冲溶液（PH6.0）微波抗原修复，蒸馏水洗2min，PBS冲洗3次，5min/次，3%H2O2室温避光孵育10 分钟，除去内源性过氧化氢酶，蒸馏水洗2min，PBS冲洗3次，5min/次，胰酶（1：1稀释）37℃恒温箱中消化20min，使抗原位点暴露，蒸馏水洗2min，PBS冲洗3次，5min/次，分别滴加一抗多克隆Ub、UbE1 （用PBS稀释1：100、1：100），4℃冰箱孵育过夜，复温，PBS冲洗3次，5min/次，滴加兔二抗IgG（PV6001），37℃孵育30min，PBS冲洗3次，5min/次，DAB液显色，苏木精轻度复染，常规脱水、透明、封片。1.8 图像分析

通过Biomias 2000 图像分析系统进行计算分析，具有阳性表达的区域随机选取4个视野，每个视野随机选取阳性表达部位进行平均灰度值测定，平均灰度高则表达强，反之则弱。

1.8 统计方法

运用SPSS 19.0统计软件数据包进行数据分析，用均数±标准差（D）表示，两组间的比较采用独立样本T检验的分析方法，*P<0.05表示与对照组相比差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 海洛因依赖戒断大鼠模型评分、体重

大鼠在9d皮下注射递增剂量的海洛因后，用纳洛酮催促后30min内出现了湿狗样颤抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、扭体、齿颤、上睑下垂、流涎等戒断症状，对戒斷症状进行评分，短时组评分18.1±2.1，差异有统计学意义（P<0.01），长时组评分23.5±2.4，差异有统计学意义（P<0.01），正常对照组评分2.8±1.5，差异无统计学意义。短时组催促戒断症状前体重230.4±15.1，戒断后体重197.7±18.3，体重明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）；长时组催促戒断症状前体重225.6±13.9，戒断后体重186.7±16.7，体重明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）；对照组催促戒断症状前体重265.9±19.7，戒断后体重265.8±21.1，体重无明显改变。

2.2 HE染色及尼氏染色

海洛因依赖组（包括短时组和长时组）前额叶、海马区都出现正常神经元数量减少、神经元变性（包括神经元固缩、深染、偏位，细胞核仁消失，尼氏体减少）、胶质细胞增生、胶质小结形成、嗜神经现象等形态学改变，而对照组少见上述改变。尼氏染色显示海洛因依赖组Nissl小体数量减少（P<0.05），且海马区和前额叶皮质均随用药时间延长Nissl小体减少更明显（P<0.05）。

2.3 Ub免疫组织化学染色观察

Ub阳性表达广泛存在于前额叶皮质及海马区神经元的细胞质和细胞核中，免疫组织化学定量分析可见：长时组<短时组<对照组，统计有显著差异，P<0.05；前额叶皮质及海马区阳性表达比较，无统计学意义，见图1。

2.4 UbE1免疫组织化学染色观察

UbE1阳性表达广泛存在于大脑皮质及海马神经元的细胞质和细胞核中，细胞外未见表达，免疫组织化学定量分析可见：长时组<短时组<对照组，统计有显著差异，P<0.05；前额叶皮质及海马区阳性表达比较，无统计学意义，见图2。

3 讨论

海洛因容易通过血脑屏障直接作用于脑细胞，产生毒性作用。研究发现，海洛因依赖死者生前均出现不同程度的反应迟钝、情感淡漠、注意力不集中、懒言少语等表现，与阿尔茨海默病、帕金森症等神经变性疾病症状相似[3，7]。死亡病例脑组织病理学检查可见不同程度的弥漫性神经细胞变性坏死、嗜神经现象多见，可见淀粉样小体、胶质细胞增生等[3]。

本试验通过海洛因递增皮下注射成瘾、催促戒断症状法建立海洛因依赖大鼠模型，腹腔注射5.0 mg/kg纳洛酮后，大鼠出现明显的湿狗样颤抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、跳跃、齿颤、上睑下垂、流涎等症状，且体重急剧下降，与人使用海洛因后产生的戒断症状相似。本试验通过HE、尼氏染色发现，海洛因依赖大鼠前额叶、海马区都出现正常神经元数量减少、神经元变性、胶质细胞增生、胶质小结形成、嗜神经现象、Nissl小体数量减少等形态学改变，该研究与以往的研究结果相一致[3，5]，肯定了海洛因对脑组织的损害作用，提示海洛因依赖对脑组织的损伤以神经元变性、坏死为主，可能与海洛因引起呼吸抑制致全身缺氧，进而造成大量脱髓鞘改变及神经元变性有关。

泛素蛋白降解系统是细胞内一系列生命进程的重要调节方式，与疾病的发生发展关系密切。它主要由泛素、泛素启动酶（包括泛素激活酶、泛素结合酶、泛素连接酶）、26S蛋白酶体和去泛素化酶组成。泛素蛋白酶体系在高等真核生物细胞中的功能主要体现在两个方面：一方面降解细胞内的蛋白，另一方面是非降解作用，调节细胞内不同蛋白的定位和活性[8]。泛素活化酶1（ubiquitin-activating enzyme 1，UbE1）可以活化所有参与结合反应的泛素，并将活化泛素转移到E2酶。张利达[9]等对脱毒大鼠针刺百会和大椎治疗发现，减少神经细胞凋亡，调节大鼠海马、中脑腹侧背盖区（VTA）的Ub、E3、26s mRNA和蛋白的表达，可干预海洛因致脑损伤作用。本研究观察海洛因依赖大鼠脑组织中Ub、UBE1广泛定位于神经元细胞质和细胞核中，甚至在轴突和树突中也有表达，应用图像分析阳性信号显示，Ub、UBE1在海洛因依赖长时组、短时组中表达水平均较正常对照组有不同程度的降低（p<0.05）。目前已知，蛋白质的多泛素化是一种控制信号，凡被Ub标记的蛋白质最终被降解。一些易聚集蛋白（如Tau蛋白、α-Synuclein、淀粉样前体蛋白等）有纤维状的形态学特点，不易被相应的酶降解，并且异常蛋白的增加和脑内的聚集在神经变性疾病的发病机制中起着关键作用，可对神经元产生毒性作用[10]。泛素蛋白酶体系统具有识别这类多余的和错误折叠的蛋白质，以保持细胞内蛋白质平衡的作用，UbE1失活和泛素化水平功能障碍是致死性的。由实验结果可见，海洛因依赖成瘾可致额叶、海马区脑组织的UbE1表达量减少，且泛素化水平降低，可以推测泛素蛋白酶体系功能紊乱可能是海洛因对大鼠成瘾复吸或脑组织损害的原因之一。

（通讯作者：汪元河）

参考文献

[1]蔡兴慧，宋小鸽，张荣军.针刺对海洛因复吸大鼠脑神经元超微结构变化的影响[J].中国药物依赖性杂志，2012，21（01）：26-29.

[2]黄仕美，臧贵勇，王杰等.吸食海洛因死亡60例法医学分析[J].贵阳医学院学报，2013，38（02）：203-205.

[3]刘碧萱.海洛因依赖患者戒断期临床表现以及非替代治疗疗效观察与分析[J].中国医药指南，2011，9：103-104.

[4]刘天明.21例海洛因中毒性神经系统损害临床分析[J].中国工业医学杂志，2011，24（01）：25-26.

[5]胡赟，梁文妹，李一欣等.海洛因依赖大鼠颌下腺IL-1、TNF表达的改变[J].实验动物科学，2017，34（06）：1-5.

[6]周君，陈勤.神经细胞尼氏体染色方法改良[J].生物学杂志，2010，27（05）：94-95.

[7]刘徽婷，王嘉军.海洛因依赖者神经一内分泌一免疫功能损伤[J].中国药物依赖性杂志，2009，18（01）：10-12.

[8]袁莉刚，赵兴绪，刘英.泛素-蛋白酶体通路在神经系统中的生物学功能[J].中国兽医科学，2007，37（05）：444-448.

[9]張利达，曹江鹏，蔡兴慧等.针刺调控泛素蛋白酶体途径对干预海洛因脑损伤的影响[J].针灸推拿医学 英文版，2018，2：80-88.

[10]刘英华，罗健东.蛋白酶体活性抑制对大鼠海马tau蛋白的泛素化影响[J].实用医学杂志，2011，27（03）：386-389.

作者简介

黄仕美（1982-），女，贵州省贵阳市人。硕士学位。贵州医科大学法医学院讲师，兼主检法医师。主要研究方向为神经病理。