电场增强锰掺杂硫化锌量子点室温磷光的肝素钠多糖检测

邓茗月，叶翆红，邹文生，李卫华

(1.安徽建筑大学 环境与能源工程学院，安徽 合肥 230601；2.安徽建筑大学 材料与化学工程学院，安徽 合肥 230601)

0 引言

肝素钠是带负电荷最多、由三磺酸二糖重复单元组成的线性多糖，主要用作抗凝剂[1]。过量的肝素钠会诱导大出血和血小板减少[2]，因此，对肝素钠的检测显得十分必要。迄今，发展简单、可靠的生物流体中肝素钠检测方法已经引起了相当大的关注[3-6]。除了传统的激活凝血时间法与活化凝结时间法等，由于具有操作方便与成本低廉的优势，光学传感器包括荧光法[7-9]、光散射法[10-12]和比色法[2，8-9]，目前已得到很大发展。这些传感器的设计原理均基于带正电的有机染料与带负电的肝素钠之间的静电作用[7-13]。南开大学的王荷芳教授[14]发展了一种聚乙烯亚胺包裹的Mn掺杂ZnS量子点(Mn-ZnS QDs)检测肝素钠技术，由于肝素钠荷负电引起了荷正点的Mn-ZnS QDs的点间聚集，肝素钠负电荷产生的电场诱导了Mn-ZnS QDs的RTP增强，根据RTP的强度变化与肝素钠浓度的关系，达到了检测肝素钠的目的。由于磷光的长发射寿命能够很容易地避免体系的自荧光与散射光[15]，在很多掺杂半导体体系中研究了主体半导体与掺杂剂的室温磷光(Room-temperature phosphorescence，RTP)[16-21]。Mn-ZnS QDs用作室温磷光探针，已经广泛应用于传感与分析领域[22-25]。

本文报道了一种基于Mn-ZnS QDs的RTP方法检测肝素钠。合成了荷正电的八胺丙基寡聚硅(OA-POSS)与荷负电的半胱氨酸包裹的Mn-ZnS QDs。当OA-POSS加入到半胱氨酸包裹的Mn-ZnS QDs的溶液中，由于静电作用使Mn-ZnS QDs发生点间聚集，形成OA-POSS与Mn-ZnS QDs聚集复合物，OA-POSS的电场诱导了RTP的增强。当荷更高负电的肝素钠加入到上述体系中，由于肝素钠与OA-POSS间更强的静电作用，使OA-POSS从聚集复合物中剥离，形成新的OA-POSS与肝素钠聚集复合物，旧的聚集复合物的破坏使Mn-ZnS QDs的RTP逐渐衰减，这种衰减的RTP信号被用来检测肝素钠。衰减的RTP强度(ΔP)和肝素钠浓度在2.5 μM到70 μM范围内存在着很好的线性相关关系(R=0.991)，检测限为2.0 μM。重要的是，Mn-ZnS QDs应用于环境流体中肝素钠的检测，有效消除了背景荧光与散射光的干扰，且作为肝素钠的传感平台具有很好的应用前景。

与Mn-ZnS QDs荷相反电荷的物质能够诱导Mn-ZnS QDs静电组装，从而缩短QDs间距离并形成更大的粒子，依次导致了下面三个结果:(1)单个Mn-ZnS QDs上的缺陷可以被临近QDs修复；(2)由于组装提的形成，相当于QDs表面的Mn2+分布重排到内部，导致更高的Mn2+发射[26]；(3)QDs周围增强的定域电场增加了QDs间的库仑作用，能够更有效地诱导QDs的激发[14，27]。上述的每一个方面都有助于Mn-ZnS QDs发射的增强。每个OA-POSS分子带八个正电荷，而先前工作中合成的半胱氨酸包裹的Mn-ZnS QDs带负电(约-32mV)[28]，那么可以设想:当OA-POSS与半胱氨酸包裹的Mn-ZnS QDs发生静电自组装，由于静电作用使Mn-ZnS QDs发生点间聚集，就会产生上述三种作用，从而诱导Mn-ZnS QDs的RTP的增强。此外，当荷更高负电的肝素钠(约-60mV)加入到上述体系中，发生三组分竞争，由于肝素钠与OAPOSS间更强的静电作用，剥离促使Mn-ZnS QDs发生聚集的OA-POSS，形成新的OA-POSS与肝素钠聚集复合物，使Mn-ZnS QDs增强的RTP逐渐衰减，这种衰减的RTP信号可用来检测肝素钠，见下图1。为了证明上述设想的科学性，我们就Mn-ZnS QDs与OA-POSS间的作用，以及由此产生的光谱信号变化进行了研究。

1 实验部分

1.1 材料

氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、半胱氨酸和肝素钠均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。ZnSO4·7H2O、MnCl2·2H2O 和 Na2S·9H2O 等购自国药集团。其它试剂均为分析试剂级。实验用水均为超纯水。

图1 结构示意图

1.2 仪器

分别用F-4600(日立，日本东京)和日立紫外UV-2910紫外-可见分光光度计记录荧光光谱和紫外-可见吸收光谱。在Nicolet-6700分光光度计(Nicolet，Madison，WI，USA)上，用 KBR 窗口测量了傅里叶变换红外光谱(FT-IR)。在JEL-200CX(JEOL，日本东京)显微镜上对透射电子显微镜(TEM)进行了表征，加速电压200 kV。利用Al Ka X射线源(1486.6eV)用XPS仪器(美国热ESCALAB 250)进行了X射线光电子能谱(XPS)测试。在岛津XRD-6000型衍射仪上，用Cu KA射线衍射仪测定了粉末X射线衍射谱。酸度用SartoriusPB-10 pH 计测定(Sartorius，Diatekon，瑞士)。以氢灯为光源，365 nm为激发波长，在爱丁堡谱仪F 900上记录了荧光寿命的测量结果。

1.3 Mn-ZnS QDs的合成

量取 5.0 mL ZnSO4·7H2O(0.1 M)和 30 mg 半胱氨酸于烧杯中，用超纯水溶解并稀释到50 mL，将体系的pH调整为11.0，将溶液转移到圆底烧瓶中搅拌 20 min后，注入 1.5 mL MnCl2·2H2O(0.01M)，30 min 后注入 5 mL Na2S(0.1M)，继续搅拌30 min，上述过程全程充氮除氧。将溶液加热到50°C，在有氧环境下陈化2 h后，自然冷却至室温，转移至烧杯中，加入2倍体积乙醇后静置1天，3000转速下离心10 min，将得到的沉淀储存于4°C冰箱中备用。

1.4 OA-POSS的合成

在典型的合成中，氨丙基三乙氧基硅烷作为溶胶-凝胶法的先驱被使用。取20 mL氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和160 mL甲醇于烧杯中，搅拌混合。在混合后的混合物中加入27 mL 0.1M的盐酸，混合液搅拌一个星期直至OA-POSS白色粉末沉淀物出现，该沉淀即为OA-POSS。

1.5 样品分析

实验用水样取自合肥污水厂，水样通过0.45 μM微孔滤膜过滤，并将pH调整为7.4，储存于4℃的冰箱中备用。

2 结果与讨论

2.1 Mn-ZnSQDs与OA-POSS间的自组装

量子点是最具吸引力的纳米粒子之一，与有机染料相比有着很多优势，比如可调发射和高量子产率等。Mn-ZnS QDs近年来被用作为室温磷光探针[22-25]。这种类型的量子点可以通过静电组装形成聚集体而增强RTP发射，还可以有效避免散射光和自荧光。OA-POSS分子是八个APTES聚合的，八个角上的胺基容易结合质子，形成荷八个正电荷的寡聚硅。两种荷相反电荷的材料在同一体系中容易发生静电自组装作用。量子点的ζ电位被检测为6.42mV，量子点带正电荷，表明此测试方法是基于OA-POSS和半胱氨酸包裹的Mn-ZnS QDs之间的静电作用[29]。

如图2所示，Mn-ZnS QDs和OA-POSS形成的纳米复合物的RTP光谱展示了此QDs的发射峰位于576 nm处。对于50 mg/L的Mn-ZnS QDs溶液中，随着加入的OA-POSS的浓度从0逐渐增加时，QDs的RTP发射强度随之增强。当加入的OA-POSS的浓度为75 μM时，RTP强度达到最大值，而后随着OA-POSS的继续加入，RTP开始衰减。此外，QDs和OA-POSS形成的纳米复合物的磷光强度在pH为7.0时能够保持稳定，且可以维持80 min以上，表明了此纳米复合物结构的稳定性。

利用UV-vis光谱研究了不同组分间的相互作用。如图2b所示，检测了OA-POSS(曲线1)、肝素钠(曲线 2)和 Mn-ZnS QDs(曲线 3)从 200到 500 nm的吸收光谱。当OA-POSS加入到QDs的溶液中，导致了QDs的吸光度的增强(曲线4)。QDs和OA-POSS形成的纳米粒子溶液中加入肝素钠会致使其吸收度的增大(曲线5)。如图2c所示，肝素钠的吸光度随着加入的OA-POSS浓度的增大而增强，这是由于肝素钠与OA-POSS之间形成了紧凑的光散射粒子。同样地，随着加入的肝素钠浓度的增强，QDs和OA-POSS形成的纳米复合物的吸光度也随之增大(见图2d)。上述现象表明了QDs与OA-POSS之间发生了相互作用，且肝素钠与QDs和OA-POSS形成的纳米复合物之间也存在着相互作用。透射电镜成像亦用于研究OA-POSS与Mn-ZnS QDs之间以及OA-POSS与肝素钠之间的相互作用。如图3(a)所示，OA-POSS加入到Mn-ZnS QDs溶液中，由于荷相反电荷，两者间通过静电自组装成纳米复合物。同样地，将OA-POSS加入到肝素钠溶液中，也会形成纳米复合物，如图3(b)。

图2 RTP及UV-vis光谱图

2.2 肝素钠滴定OA-POSS与Mn-ZnS QDs纳米复合物的RTP光谱

肝素钠可以诱导PEI包裹的Mn-ZnS QDs之间的发生静电聚集而缩短点间距离，促使QDs间形成更大的粒子[14]。为了证实Mn-ZnS QDs与OA-POSS之间形成的纳米复合物探测肝素钠的可能性，我们研究了肝素钠对纳米复合物的RTP的影响。如图4所示，QDs与OA-POSS形成的纳米复合物的增强的RTP随着肝素钠的加入而逐渐衰减，表明QDs与OA-POSS形成的纳米复合物与肝素钠之间存在着相互作用，这可能是由于肝素钠的荷电更负，夺取了QDs与OA-POSS纳米复合物中的OA-POSS，导致了纳米复合物的解组装，电场破坏以后，由电场引起的RTP增强随之衰减，并接近原始强度。反之，当肝素钠加入到Mn-ZnS QDs溶液中(不存在OA-POSS)中，QDs的磷光发射强度几乎没有改变，这是由于两者荷负电引起的。以上的光谱变化表明QDs与OA-POSS形成的纳米复合物的RTP发射强度的衰减起因于OA-POSS和肝素钠之间的相互作用。也研究了肝素钠滴定前后的Mn-ZnS QDs的寿命变化，6.3毫秒左右的寿命符合静态猝灭规律，说明了静电作用的存在。

图3 透射电镜(TEM)成像图

2.3 肝素钠的RTP检测和条件优化

Mn-ZnS QDs与OA-POSS形成的纳米复合物的在576 nm处的RTP发射用于肝素钠的检测，目的在于评估此纳米复合物的肝素钠定量的潜在可行性。如图5所示，猝灭的磷光强度(ΔP)和肝素钠浓度在2.5到70 μM范围内存在着很好的线性相关关系(R=0.991)，检测限为2.0 μM，且5次测量的相对标准偏差(RSD)为6.9%。

考察了作用时间对光谱测量的影响，如图6所示，上述的RTP强度的衰减受反应时间的影响。对于不同的肝素钠的加入量，QDs与OA-POSS形成的纳米复合物与肝素钠之间的竞争相互作用在经过了大约40 min后保持持稳定。因此，本研究选择40 min作为实验的反应时间。

图4 滴定RTP光谱图

图5 使用Mn-ZnSQDs与OA-POSS纳米复合物作RTP探针的肝素钠检测校正曲线

图6 不同肝素钠浓度滴定Mn-ZnSQDs与OA-POSS纳米复合物的时间依赖性RTP光谱

2.4 基质干扰

环境样品中共存的主要的金属离子、大分子和小分子可能对肝素钠的检测存在干扰。为了考察Mn-ZnS QDs与OA-POSS纳米复合物RTP探针的对肝素钠的选择性，对可能共存的过量的金属离子(如 K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+和 Cu2+)、葡萄糖及腐殖酸等加入到含1 μM的肝素钠的Mn-ZnS QDs与OA-POSS纳米复合物体系中，检测干扰物质加入前后的RTP光谱。结果如表1所示，各种过量的干扰物质的加入对RTP强度产生的影响在±5%的范围内。此外，腐殖酸作为有机复合物的代表物，在pH为7.0的溶液中，也同样对肝素钠的检测无干扰。上述结果表明Mn-ZnS QDs与OA-POSS纳米复合物RTP探针可用于选择性肝素钠的检测。

表1 各种共存基质对Mn-ZnSQDs与OA-POSS纳米复合物RTP探针检测肝素钠的影响

2.5 实际样品分析

为了论证Mn-ZnS QDs与OA-POSS纳米复合物RTP探针的适用性，污水厂尾水被用于肝素钠的分析检测。如表2所示，尾水样品经过适当稀释后加入标准的肝素钠后，能够获得好的定量回收率(95～101%)，且可以使用一个简单的标准溶液来精确定量肝素钠。

表2 实际水样品中肝素钠探测的三次测定回收率

3 结论

总之，荷正电的OA-POSS与荷负电的半胱氨酸包裹的Mn-ZnS QDs在溶液中由于静电作用发生点间聚集，形成OA-POSS与Mn-ZnS QDs纳米复合物，OA-POSS的电场诱导了RTP的增强。当荷更高负电的肝素钠加入到上述体系中，肝素钠与QDs竞争，使得旧的纳米复合物解体，新的OAPOSS与肝素钠纳米复合物形成。旧的纳米复合物的解体使Mn-ZnS QDs的RTP逐渐衰减，并应用于复杂样品中肝素钠的选择性检测，这已经被证实是一种有效且实用的技术。