Th2型细胞因子模式转换对高级别宫颈上皮内瘤样病变的影响

季菲，李晓红，马蓉，杜蓉，刘艳佳，丁岩

(新疆医科大学第一附属医院妇科，乌鲁木齐 830054)

目前公认的高危型(HR)人乳头瘤病毒(HPV)会导致宫颈癌的发生[1-3]。大多数HPV感染对宿主没有进一步的不良后果，但有一定比例未经治疗的HR-HPV感染会导致高级别宫颈上皮内瘤样病变(CIN Ⅱ-Ⅲ)和宫颈癌[4-6]。有证据表明宿主全身与局部的细胞介导的免疫反应是感染过程中的决定因素。“免疫反应是通过释放不同的细胞因子进行，细胞因子会在形成免疫调节的网络中对合成和作用互相产生影响”。细胞免疫反应是通过T细胞[辅助型T(Th)细胞和细胞毒T细胞]与抗原递呈细胞合作调节的。细胞因子对感染所引起的免疫反应一般分为免疫刺激(肿瘤抑制)Th1型细胞因子，例如干扰素γ(IFN-γ),肿瘤坏死因子α(TNF-α),白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素12(IL-12),这些主要参与细胞介导免疫，Th2型细胞因子(IL-4,IL-5,IL-6,IL-8,IL-10)是对细胞介导反应产生免疫抑制并主要引起体液免疫[7-8]。对Th1型和Th2型细胞因子水平的定性定量分析可以用来判断人类的多种疾病，其中就包括HPV感染引起CIN的免疫反应[9]。对宫颈病变的患者或者癌症患者血浆中的细胞因子的研究不多，某些研究只讨论一个或者几个细胞因子，或者只是附带提及HR-HPV，并未深入进行研究[10-18]。本研究分析处于CIN不同阶段的HR-HPV阳性患者的外周血细胞因子模式,并与HR-HPV阳性和阴性对照组相比较。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年7—8月就诊于新疆医科大学第一附属医院妇科门诊的宫颈细胞学异常女性作为研究对象。获取宫颈细胞学、组织学和HPV样本。研究组构成包括33例女性：10例中度异型(CIN Ⅱ)女性，11例重度异型(CIN Ⅲ)女性，12例宫颈癌女性(10例鳞状细胞癌，2例腺癌)。对照组包括11例无宫颈细胞病变无高危型HPV女性和10例无宫颈细胞病变但高危型HPV测试为阳性的女性。高危型HPV阴性对照组年龄为32.4岁(病情稳定6.2年)，高危型HPV阳性对照组27.9岁(病情稳定7.4年)，CINⅡ患者33.4岁(病情稳定5.7年)，CINⅢ32.3岁(病情稳定5.5年)，浸润癌女性35.6岁(病情稳定7.2年)。纳入标准:中度异型(CIN Ⅱ),重度异型(CIN Ⅲ),或者微小浸润癌。排除标准:患者已绝经、取样时妊娠、患有慢性病(糖尿病、过敏或者自身免疫性疾病)、取样时有急性感染迹象、免疫力低下。除了口服避孕药之外，患者没有定期服用药物。在取样前至少2周患者没有使用止痛药(非甾体类抗炎药),CIN Ⅰ级病变(轻度异型)女性排除在外。研究对象中，超过50%的CINⅠ患者为HR-HPV阴性。对照组：在我院妇科门诊常规体检的健康女性。本研究方案经过我院伦理委员会批准，所有女性都已签署知情同意书。

高危型HPV感染患者和子宫颈细胞病变与高危型HPV阴性和高危型HPV阳性对照组的HPV类型见表1。各组白细胞数目见图1。

注：与CINⅡ比较，aP<0.05，bP<0.01;与CINⅢ比较，cP<0.01

图1高危型HPV感染患者和子宫颈细胞病变与高危型HPV阴性和高危型HPV阳性对照组的白细胞数目

1.2 HPV取样和测定 用于检测人乳头瘤病毒和其类型的宫颈刮片采用宫颈生物采样器(瑞典马尔默市Medscand Medical公司Accellon Combi®)采集。HPV测试如前面所述是通过对37个子类共同引物GP5/GP6聚合酶链式反应(PCR)酶免疫分析法进行[19-20]。用β球蛋白PCR来识别样本错误并监控PCR抑制物。另外，PCR酶免疫分析阳性案例中使用反向线点分析来识别个人的HPV类型。

表1 子宫颈细胞病变患者(CINⅡ,CINⅢ和癌)和HR-HPV阳性对照组的HPV类型

注：CIN为宫颈上皮内瘤；HPV为人乳头瘤病毒；下表同

1.3 血液取样及处理 用不含无菌内毒素的真空抽血管( 法国，Meylan,Becton Dickinson)采集早上8点到中午12点外周小静脉血液样本,用乙二胺四乙酸作为抗凝血剂，血浆样本在化验前在-80 ℃下保存。用Sysmex XE-2100在所有的血液样本中测出的白细胞数目均不同。

1.4 细胞因子测定 所有的血浆样本都用酶联免疫测定试剂盒(比利时尼韦尔,欧洲Biosource生产)来测定细胞因子TNF-α,可溶性TNF-α受体(sTNFR I和sTNFRⅡ),IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10和IL-12[21]。IL-12免疫检定中的检测抗体能识别活性异二聚体(p40+p35)细胞因子，还有p40亚基同型二聚体。

CINⅢ患者和宫颈癌患者的血浆IFN-γ浓度显著低于CINⅡ患者或者对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 高危型HPV阳性宫颈细胞病变患者和高危型HPV阴性和高危型HPV阳性对照组IFN-γ血浆浓度(pg/106)

注：IFN-γ为干扰素γ；下表同

TNF-α的血浆浓度在组之间差别并不大，差异无统计学意义(P>0.05)，但在CIN Ⅲ患者和宫颈癌中，TNFRⅡ的血浆浓度明显低于CIN Ⅱ，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 高危型HPV阳性宫颈细胞病变患者和HPV阴性及HPV阳性对照组的血浆TNF-α浓度及其可溶性受体sTNFRI和sTNFRII

注： TNF-α为肿瘤坏死因子α；sTNFRⅠ为可溶性肿瘤坏死因子受体I；sTNFRⅡ为可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ

1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0软件数据处理，用Spearman等级检验来调查细胞因子变量之间的相关性。选双尾P值0.05来表示差异性。用非成对双尾t测试来测定白细胞和白细胞亚群的差异。

2 结果

2.1 HPV测定结果 HPV类型16、18、31是最常检测到的高危型HPV类型(n=18，n=7，n=8)。HPV-33，n=2；HPV-35，n=1；HPV-39，n=2；HPV-45，n=1；HPV-51，n=1；HPV-52，n=2；HPV-56，n=6；HPV-58，n=1；HPV-59，n=2；HPV-82，n=1。在1例CIN Ⅲ女性中检测到HPV-70(低危型)及HPV-16，该女性成为12例女性中唯一只是单一感染患癌的个体。计有34例单一HPV感染，8例多重HPV感染的个体。表1汇总了研究组中的HPV类型。白细胞计数差别：CINⅢ和癌症患者的白细胞总数比CINⅡ患者和对照组高，CINⅡ和CINⅢ的白细胞数差别巨大。中性白细胞数也显示了类似的变化曲线，从CINⅡ到癌症有显著增加。各组的绝对单核细胞和淋巴细胞计数差别巨大，CINⅢ女性患者数值最高。图1显示了白细胞计数差别。

2.2 细胞因子水平 细胞因子化验结果是基于每一个106白细胞，以对各研究对象不同数目的细胞因子产生白细胞进行分层。通过对研究组外周血细胞因子水平的分析，本组发现了8个所调查的细胞因子每一个变化曲线都不同。各组的差别表现在IFN-γ浓度上，从CINⅡ到CINⅢ到癌症(P≤0.01)有显著减少，如表3汇总所示。

对照组和研究组的血浆TNF-α浓度差异无统计学意义。两种TNF受体在所有的组中都有显著的关联性(高危型HPV阴性对照组r=0.973，P<0.001；高危型HPV阳性对照组r=0.855，P=0.002；CINⅡ患者r=0.979，P=0.001；CINⅢ患者r=0.791，P=0.004；侵入性癌患者r=0.748，P=0.005)。TNFRⅡ数在高危型HPV阳性对照组中最高。宫颈癌患者的TNFRⅡ数比CINⅡ患者有显著减少。TNFRⅠ也显示了类似的模式，不过差异不显著。

高危型HPV阴性到高危型HPV阳性对照组血浆IL-2浓度有显著增加(P=0.037)，不过IL-2数没有显著变化。各组的IL-12没有显著差别。在大多数被调查的血浆样本中，IL-4浓度低于检测极限值。在大多数对照组女性和中度异型女性中，IL-10值低于检测极限值，不过在11例CINⅢ女性中4例能检测到，在12例浸润癌患者中7例能检测到。表4标出了IL-4和IL-10数据。

表4 高危型HPV阳性宫颈细胞病变患者、高危型HPV阴性和阳性对照组IL-4及IL-10血浆浓度

注：IL-4检测极限值，2 g/L；IL-10检测极限值，1 g/L

在所有的研究组中，通过计算Th1型细胞因子IL-12，IFN-γ，TNF-α，IL-2与Th2型稀薄因子IL-10的比率，本组得出癌症患者Th2型细胞因子可能有所增加。癌症患者的该比率与高危型HPV阳性对照组或者CINⅡ患者相比显著减少(IFN-γ与IL-10比率P<0.01,TNF-α与IL-10比率P=0.02及P<0.01,IL-2与IL-10比率P=0.03及P=0.06)。图2标出了IL-12与IL-10的比率作为例子。

图2 宫颈细胞病变HPV阳性患者和高危型HPV阴性和高危型HPV阳性对照组血浆中IL-12与IL-10的比率

3 讨论

患者的白细胞计数差别与Onsrud等[22]研究结果一致，Onsrud指出宫颈癌时，可能是由于炎症或者坏死造成白细胞和中性细胞数目增加，与健康的对照组相比，淋巴细胞绝对值有所减少。Gemignani等[23]和Balaram等[24]的研究也确认了这些结果。这为每106白细胞细胞因子数据的分层作出了解释。本研究表明重度异型和浸润癌症女性中流动IFN-γ浓度有显著减少。IFN-γ是Th1细胞、细胞毒T细胞、刺激后的自然杀伤细胞分泌的，在对HPV感染作出有效Th1型细胞免疫反应中发挥主要作用。可检测到的IFN-γ的产生可能与持续的HPV感染和HPV相关肿瘤发生有关系[25]。本组的流动IFN-γ数据与此类报告一致。TNF-α与IFN-γ在导致宫颈癌细胞凋亡或者坏死中协同发挥作用[26]。TNF-α的生物学作用由其两个受体TNFRⅠ和TNFRⅡ介导。这两个受体在很多细胞类型和组织中都存在；TNFRI 在对TNF-α毒性作用敏感的细胞中非常多见，而TNFRⅡ在刺激后的T和B细胞中非常多见[27]。包括TNF-α本身，一些细胞因子对两种受体的细胞表面反应通过对细胞外区域进行蛋白质裂解成为可溶性蛋白sTNFRⅠ和sTNFRⅡ流出，进入循环系统。对这两种可溶性受体，特别是sTNFRⅡ的检测通常用来评估Th1型细胞在细胞介导免疫反应中的行为[27-29]。本研究发现各组的TNF-α值没有显著区别。不过，癌症患者血浆中这两种可溶性受体浓度有所减少，sTNFRⅡ则显著减少。该结果反映了发展为CINⅢ和浸润癌后，流动TNF-α减少，Th1型免疫反应被扰乱。在本研究组中，外周血Th1型细胞因子IL-2浓度除了从高危型HPV阴性到高危型HPV阳性对照组有些许增加(P=0.037)之外没有显著区别，该增加可能显示了对病毒性感染的抗感染反应。“白细胞介素10浓度随着异生的严重性而显著增加”。在宫颈癌发展过程中可能转化成Th2型细胞因子，这可能表现在血浆中Th2型细胞因子IL-4和IL-10浓度增加。不过，在研究组中没有发现IL-4浓度有显著区别。IL-10浓度随着宫颈上皮内瘤样病变的程度而显著增加。IL-10是有效的免疫抑制细胞因子，其抑制T细胞活性和Th1细胞分化。Jacobs等[18]将向Th2型的转化描述为高级别鳞状上皮内病变患者 IL-12与IL-10比率显著减少。IL-12是诱导细胞介导免疫的关键细胞因子，其促使T细胞分化成IFN-γ，产生Th1细胞，促使自然杀伤细胞产生IFN-γ。在本研究中发现的CINⅢ患者和癌症患者IL-12,IFN-γ，TNF-α和与IL-10相关的IL-2显著减少，支持并延伸了Jacobs等[18]在重度宫颈异生和宫颈癌发展时扰乱的细胞免疫反应的发现。在所有的参与者中，本组排除了能够影响循环细胞因子浓度的疾病，所以本组推定这些结果是HPV感染的后果。本组发现从异型到浸润癌的不同阶段的循环中的干扰素γ和肿瘤坏死因子α受体Ⅱ有显著减少，白细胞介素10浓度增加。这些结果显示宫颈上皮内瘤(CIN)Ⅲ 病变女性宫颈癌癌变过程中向辅助性T2型(Th2)细胞因子转化，在治疗CINⅡ和CINⅢ患者时进行预防接种，使Th2型反应转化为Th1型反应可能有效果。本组发现的宫颈异型和浸润癌外周细胞因子转化不一定跟公布的细胞因子数据一致[10-18]。在Niwa等[10]的研究中，宫颈癌患者和对照组血浆中IFN-γ浓度相似，而在Lebrecht等[11]的研究中，在所有的组中IFN-γ浓度均低于检测极限值。本组血浆TNFRI浓度发现宫颈癌患者与良性病变子宫肌瘤女性相比，血清sTNFRI浓度非常低。不过这与Malejczyk等[16]的结果不同，在其研究中，HPV-16关联的CINⅠ/Ⅱ和CINⅢ病变、HPV-16/18相关的鳞状细胞宫颈癌患者与健康对照组进行了比较。CIN病变女性和对照组在受体数值上没有显著差别，不过两种受体浓度在宫颈癌患者中有显著增加。造成与此前研究结果不同的重要因素包括对照组和患者的选择标准。在本研究中，根据他们感染高危型HPV的状态选择患者和对照组。1例宫颈癌女性为低危型HPV70的个案可以解释为高危型HPV DNA通过细胞基因组L1区域进行结合，这在GP5+/6+ PCR中可能被遗漏。除了Jacobs等[18]和Malejczyk等[16]的研究之外，上面所提到的研究中都没有研究HPV的存在。而且，白细胞数的分层可能也能解释这些不一致之处。免疫活性白细胞是循环细胞因子的主要产生来源。与其他研究相比，本研究是根据白细胞数计算结果的，而不是根据每毫升血浆。最后，细胞因子检测的分析方法可能不一样。有些研究用血浆，有些研究用血清，这种选择可能会影响数据结果。有些研究都使用酶联免疫测定试剂盒，有些由不同的厂家生产。这说明使用不同的抗体系统来粘合细胞因子并量化其敏感度不一。本研究结果显示CINⅢ病变女性中向Th2细胞因子模式转换已经很明显。这为临床治疗所有CINⅢ病变女性的原则提供了理论基础。另外，这也可能表明，宫颈癌患者预防接种可能使Th2型反应转为Th1型反应，这在CINⅡ病变女性中可能也有一定的作用。

总之，本研究表明了不同阶段的宫颈上皮内瘤样病变到发展为浸润癌的过程中高危型HPV感染的外周细胞环境的特征性变化： IFN-γ和sTNFRⅡ显著减少，IL-10浓度增加。这表明在宫颈癌发展过程中模式向Th2型免疫反应转化。在CINⅢ患者中细胞介导免疫表现明显，这和大多数CINⅢ病变如果没有正规治疗，并不会自动减轻，而可能最终发展为浸润癌的临床观点一致[30]。