TTC法快速测定芍药种子生活力

(中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112)

芍药(PaeonialactifloraPall.)是芍药科芍药属多年生草本植物[1]，与牡丹并称为姐妹花，被世人尊称为“花相”，观赏价值极高[2]，其根部入药，可以加工成赤芍或白芍，赤芍具有清热解毒和散瘀止痛的功效，白芍具有平肝止痛、养血调经和敛阴止汗的功效[3]。芍药的繁殖方式有分株法和种子繁殖法[4]，芍药种子具有上下胚轴双重休眠特性[5]，萌发时必须先打破下胚轴休眠再打破上胚轴休眠，种子才能萌发[6]。种子15 ℃沙藏层积45 d后，种子裂口露白打破下胚轴休眠，15 ℃沙藏层积122 d后，根长达到3～4 cm转为4 ℃低温层积，28 d后打破上胚轴休眠[7]，打破上下胚轴休眠而萌发需要5个月时间，无法快速测定种子发芽率。TTC染色法是《国际种子检验规程》中用于测定种子生活力、判断种子发芽潜力的一种有效方法[8]，具有快速、有效、准确的特点。用种子生活力预测发芽率是芍药生产中迫切需要解决的技术。本研究通过正交试验设计，分析各个因素对芍药种子生活力测定值的影响，以期找到TTC染色最佳条件，实现种子活力的快速测定，为芍药种子质量检测提供技术支撑。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的芍药种子于2017年8月初购自辽宁省抚顺市东洲区哈达镇，经中国农业科学院特产研究所郭靖副研究员鉴定为芍药种子，保存于4 ℃冰箱内备用。

1.2 发芽率测定

供试的芍药种子用流水冲洗干净后，用0.5%的高锰酸钾溶液消毒40 min，再用蒸馏水冲洗干净。将消毒后的种子放入100 mg/L GA3溶液中，置于45 ℃恒温箱避光浸种48 h后，将种子埋入消毒过的沙子中，于室温条件下进行保湿催芽。经常检查种子发芽情况，以胚根突破种皮2 mm 以上为发芽的标准。从发芽开始每隔5 d统计1次发芽情况，连续10 d没有新发芽的种子视为发芽结束[4，7,9-10]。

1.3 TTC染色方法

1.3.1正交试验设计

采取L16(45)5因素4水平正交试验，设置(表1)，以浸种温度、浸种时间、TTC浓度、染色温度及染色时间5个直接影响种子生活力测定的因素作为检测指标，并设置4个不同的水平，进行正交试验。

表1 正交设计因素水平

水平试验因素A 浸种温度(℃)B 浸种时间(h)C TTC浓度(%)D 染色温度(℃)E 染色时间(h)12560.1256230120.33012335180.535184402414024

1.3.2TTC染色试剂的配制

磷酸缓冲溶液的配制：溶液甲，称取7.802 5 g NaH2PO4·2 H2O 溶解于500 mL双蒸水中；溶液乙，称取17.91 g Na2HPO4·12 H2O 溶解于500 mL双蒸水中。取195 mL 溶液甲和305 mL 溶液乙混合即成。

不同浓度 TTC 溶液配制[8]： 0.1% TTC 溶液配制，称取0.1 g氯化四唑粉剂溶解于100 mL磷酸缓冲溶液，按此法分别配制0.1%、0.3%、0.5%、1.0% TTC溶液，于棕色瓶中4 ℃冰箱避光保存备用。

1.3.3浸种处理

将芍药种子置于三角瓶中，加入双蒸水至完全浸没种子，每份加入等量双蒸水，分别置于25，30，35 ℃和40 ℃的恒温箱内浸泡处理6，12，18 h和24 h，使种子充分吸水。每个处理组合种子30粒，重复3次。

1.3.4染色前的准备

取出浸泡后的种子，用滤纸吸干种子表面的水分，用解剖刀将种子沿种脐纵切，以不损伤胚为佳，选取保留胚的一半种子，置于染色盘内备用。

1.3.5染 色

将等量浓度为0.1%、0.3%、0.5%、1.0%的TTC溶液分别加入不同的染色盘内，至芍药种子完全浸没。之后，将染色盘分别置于25，30，35，40 ℃的恒温箱内避光染色，并分别于6，12，18，24 h后取出，倒出TTC溶液，用双蒸水冲洗种子3次，再用滤纸吸干将种子表面的水分。

1.3.6染色后观察

在40倍解剖镜下观察胚和胚乳的染色效果，并记录染色情况。判断种子是否有生活力的标准为：胚及胚乳全部染色、胚全部染色但是胚乳20%未染色的种子为有生活力的种子；胚及胚乳未染色、胚未染色但胚乳大部分染色、胚染色但胚乳未染色的种子为无生活力的种子[7]。

1.4 数据处理

采用统计分析软件SAS 9.2对数据进行统计分析，筛选TTC法测定芍药种子生活力最佳条件。

种子生活力(%)=(有生活力的种子数/供试种子总数)×100%；

种子发芽率(%)=(发芽种子数/供试种子总数)×100%。

2 结果与分析

2.1 种子发芽率测定结果

发芽试验结束后，统计芍药种子4次重复发芽数目分别为30、29、30、30粒，发芽率平均值为99.17%。

2.2 种子生活力测定正交试验结果

采用TTC染色测定芍药种子生活力正交试验结果见表2。种子生活力最高为100%，相应的处理组合为处理组合2(25 ℃浸种12 h、0.3%TTC浓度30 ℃避光染色12 h)和处理组合12(35 ℃浸种24 h、0.3%TTC浓度25 ℃避光染色18 h)，生活力测定值最低为处理组合1，即25 ℃浸种6 h、0.1%TTC浓度25 ℃避光染色6 h，该组合染色效果差，芍药种子染成淡粉色或不染色。

2.3 极差分析

比较各因素对芍药种子活力的影响，对所得正交试验数据进行极差分析(见表2)，极差值R 1=83.33，R 2=111.12，R 3=108.89，R 4=92.22，R 5=110.00。5个因素对芍药种子生活力的影响大小依次为：浸种时间>染色时间>TTC浓度>染色温度>浸种温度，即染色时间对芍药种子生活力测定值影响最大，其次是浸种时间和TTC浓度，而染色温度和浸种温度的影响相对较小。

进一步通过Ⅰj、Ⅱj、Ⅲj、Ⅳj进行分析，挑选因素所对应的最大值来代表适合测定芍药种子生活力条件。浸种温度(因素A)：Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1、Ⅳ1中Ⅱ1值最大，浸种温度可以选30 ℃；浸种时间(因素B)：Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2、Ⅳ2中Ⅳ2值最大，Ⅳ2=392.23，Ⅱ2=380.01，二者相差12.22，差异不大，可以将浸种时间从24 h降为12 h；TTC浓度(因素C)：Ⅰ3、Ⅱ3、Ⅲ3、Ⅳ3中Ⅲ3值最大,Ⅲ3=388.90，Ⅱ3=378.89，二者相差10.01，差异不大，可以将TTC浓度从0.5%降为0.3%；染色温度(因素D)：Ⅰ4、Ⅱ4、Ⅲ4、Ⅳ4中Ⅱ4值最大；染色时间(因素E)：Ⅰ5、Ⅱ5、Ⅲ5、Ⅳ5中Ⅱ5值最大。综上可得出A2B2C2D2E2为较优组合，即芍药种子30 ℃浸种12 h，30 ℃条件下0.3%TTC溶液避光染色12 h。

表2 TTC法测定种子生活力的正交试验结果

处理组合因素 A因素 B因素 C因素 D因素 E平均生活力1A1(25)B1(6)C1(0.1)D1(25)E1(6)0.00±0.00e2A1(25)B2(12)C2(0.3)D2(30)E2(12)100.00±0.00a3A1(25)B3(18)C3(0.5)D3(35)E3(18)95.56±1.11abc4A1(25)B4(24)C4(1)D4(40)E4(24)97.78±1.11ab5A2(30)B1(6)C2(0.3)D3(35)E4(24)91.11±2.22cd6A2(30)B2(12)C1(0.1)D4(40)E3(18)95.56±1.11abc7A2(30)B3(18)C4(1)D1(25)E2(12)91.11±2.22cd8A2(30)B4(24)C3(0.5)D2(30)E1(6)98.89±1.11ab9A3(35)B1(6)C3(0.5)D4(40)E2(12)97.78±1.11ab10A3(35)B2(12)C4(1)D3(35)E1(6)87.78±2.22d11A3(35)B3(18)C1(0.1)D2(30)E4(24)88.89±2.22d12A3(35)B4(24)C2(0.3)D1(25)E3(18)100.00±0.00a13A4(40)B1(6)C4(1)D2(30)E3(18)92.22±2.94bcd14A4(40)B2(12)C3(0.5)D1(25)E4(24)96.67±3.33abc15A4(40)B3(18)C2(0.3)D4(40)E1(6)87.78±1.11d16A4(40)B4(24)C1(0.1)D3(35)E2(12)95.56±1.11abcⅠj293.34 281.11 280.01 287.78 274.45 Ⅱj376.67 380.01 378.89 380.00 384.45 Ⅲj374.45 363.34 388.90 370.01 383.34 Ⅳj372.23 392.23 368.89 378.90 374.45 Rj83.33 111.12 108.89 92.22 110.00

注：表中同列不同小写字母表示p<0.05差异显著；数据表示平均值±标准误差。

2.4 方差分析

对正交试验数据进行方差分析得到表3，试验设定的5个因素中都对试验结果具有显著的影响，且影响达到极显著差异水平(p<0.01)，即浸种温度、浸种时间、TTC浓度、染色温度和染色时间对TTC染色测定芍药种子生活力值都起主要作用。

3 结论与讨论

3.1 TTC法测定芍药种子生活力的最佳条件

本研究发现，生活力达到100%的处理组合分别为处理组合2和处理组合12，该2个处理组合染色效果较好呈均匀的鲜红色，从染色效果、节约时间、节约试剂以及减少TTC溶液带来的环境污染4个角度出发[11-13]，处理组合2较为适宜，即25 ℃浸种12 h、0.3%TTC浓度30 ℃避光染色12 h。经过进一步分析得出，30 ℃浸种12 h，0.3%TTC溶液30 ℃避光染色12 h为较优组合，该组合比处理组合2除了浸种温度不同，其他各个条件都相同，前者的浸种温度为30 ℃，后者的浸种温度为25 ℃，通过比较Ⅰ1=293.34、Ⅱ1=376.67，二者相差83.33，差异较大，浸种温度应选择30 ℃。综上所述，芍药种子TTC染色的最佳条件为A2B2C2D2E2，即芍药种子30 ℃浸种12 h后，0.3%TTC溶液30 ℃避光染色12 h。

表3 方差分析

方差来源自由度平方和均方F值显著性浸种温度(A)33707.991236.00136.24**浸种时间(B)35652.601884.20207.70**TTC浓度(C)35650.621883.54207.62**染色温度(D)34453.071484.36163.62**染色时间(E)36400.742133.58235.19**误差30272.169.07

注：R2=0.99,“**”表示在0.01水平上具有极显著差异。

3.2 TTC法测定芍药种子生活力的可行性

本研究所选用的实验材料为新采收的芍药种子，测得种子发芽率为99.17%，生活力为100%，其生活力略高于发芽率。同一种子样品中，种子生活力应该大于或者等于发芽率[14]。TTC染色法是目前国际公认测定种子生活力的方法，可以用来估测种子潜在的发芽能力[15-16]。采用TTC法测定芍药种子的生活力时，浸种时间加上染色时间仅需24 h，而常规发芽试验需要5个月，因此当生产中急需了解芍药种子质量时，可先用TTC染色法测定种子的生活力来判断种子潜在的发芽能力[17]。本研究结果表明,TTC染色法测定芍药种子生活力具有可行性，在生产实践中有一定的应用价值。