姜枣祛寒颗粒质量标准研究

宿曼筠，王友兰，吴爱英

（山东省青岛市食品药品检验研究院，山东 青岛 266071）

姜枣祛寒颗粒由干姜和大枣组方，功效为发散祛寒、和胃温中，用于风寒感冒、胃寒疼痛。现行标准收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第二册）》［1］，其中仅有干姜对照药材的鉴别，且涉及挥发性较大的有害试剂苯及易制毒试剂乙醚。为了更全面地控制该制剂的内在质量，本研究中增加了6-姜辣素对照品及大枣对照药材的薄层色谱（TLC）鉴别，并采用高效液相色谱（HPLC）法对干姜的有效成分6-姜辣素进行了方法学考察和含量测定。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；Auto Science AS10200BT型超声波清洗器（杭州汇尔仪器设备有限公司）；ZF7-C型三用紫外分析仪（上海康华生化仪器制造有限公司）；Si60型硅胶板默克化工技术＜上海＞有限公司，批号为HC39961356，规格为10 cm×20 cm）。

1.2 试药

6-姜辣素对照品（批号为111833-201303），干姜对照药材（批号为120942-201510），大枣对照药材（批号为121040-201408），均购自中国食品药品检定研究院；姜枣祛寒颗粒（厂家HRSJ、厂家SXHK、厂家ZTJD，共11批，规格为每袋15 g）；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

干姜：取本品5 g，研细，加二氯甲烷-甲醇（2∶1）20 mL，超声处理15 min，滤过，滤液浓缩至干，加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取干姜对照药材0.5 g，同法制备对照药材溶液。再取6-姜辣素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方比例和制法制得不含干姜的样品，按供试品溶液制备方法制得干姜阴性对照溶液。照2015年版《中国药典（四部）》通则0502薄层色谱法试验，分别吸取上述溶液各 5 μL，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯 -甲醇-冰醋酸（20∶3∶2∶0.4）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱和对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，且阴性对照无干扰。结果见图1。

图1 干姜薄层色谱图

大枣：取大枣对照药材1 g，加水50 mL，煎煮1 h，实时补充减失的水分，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷-甲醇（2∶1）20 mL，按干姜鉴别项下供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按处方比例和工艺制得不含干姜的样品，按干姜鉴别项下供试品溶液制备方法制得大枣阴性对照溶液。照2015年版《中国药典（四部）》通则0502中TLC法试验，吸取上述溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。结果见图2。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

图2 大枣薄层色谱图

色谱柱：Accurasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 -甲醇 -0.1%磷酸溶液（40∶5∶55）；检测波长：280nm；流速：1.0mL／min；柱温：35℃；进样量：10μL。理论板数按6-姜辣素峰计应不低于5 000。

2.2.2 溶液制备

对照品溶液：取6-姜辣素对照品适量，精密称定，加甲醇超声溶解并定容至刻度，混匀，作为对照品贮备液，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，即得。

供试品溶液：取样品10袋，倾出内容物，研细，取5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，称定质量，超声处理（功率为100 W，频率为40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照溶液：按处方比例及工艺配制缺干姜的阴性制剂，按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样测定。结果在对照品溶液色谱峰相应的保留时间处，阴性对照溶液无色谱峰出现，说明阴性对照无干扰。结果见图3。

线性关系考察：分别精密吸取上述对照品溶液（质量浓度为 0.023 1 g／L）2，5，10，15，25 μL，按拟订色谱条件进样测定，以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，得6-姜辣素回归方程Y＝585 443X-1 194.4，r＝1（n＝5）。结果表明，6-姜辣素进样量在46～578 ng范围内与峰面积积分值线性关系良好。

图3 高效液相色谱图

精密度试验：精密吸取上述对照品溶液10 μL，按拟订色谱条件重复进样6次，测定峰面积积分值。结果的RSD为0.30%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为150108）适量，依法制备供试品溶液，分别于 0，2，8，12，24 h 时进样分析，测定峰面积积分值。结果的RSD为0.38%（n＝5），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取样品（批号为150108），依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件重复进样6次，测定。结果平均含量为每袋 1.40 mg，RSD为 1.40%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为150108），研细，称取约 2.50 g，共 6 份，精密称定，精密加入对照品溶液（质量浓度为 0.011 5 g／L）20 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，计算加样回收率。结果见表1。

2.2.4 耐用性试验

流动相比例考察：以乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相，对流动相的比例稍加调整，进行分析。结果见表2。可见，流动相中乙腈用量减少，6-姜辣素的保留时间有所延长，含量未发生变化，流动相组成比例的适量变化不影响结果。

表2 流动相比例考察结果（n＝2）

色谱柱考察：选用3种不同的色谱柱，按拟订色谱条件进样分析，测定6-姜辣素的峰面积。结果6-姜辣素平均含量为每袋 1.42 mg，RSD为 0.70% （n＝2），表明不同色谱柱对结果影响较小。

2.2.5 样品含量测定

2.2.2项下方法制备供试品溶液，依法进样测定，记录峰面积并计算其含量。结果见表4。

表3 色谱柱耐用性试验结果（n＝2）

表4 各批样品的含量测定结果（mg／袋）

3 讨论

3.1 干姜定性鉴别的修订

原标准［1］中提取溶剂乙醚属易制毒试剂，改用二氯甲烷-甲醇（2∶1）提取溶剂毒性较小，且可同时适用于干姜和大枣的鉴别，既简化了操作步骤，又节约了溶剂，因此选用此系统为提取溶剂。原标准使用1 g对照药材，供试品取样量折算干姜的用量约为0.4 g，结合试验验证结果，将干姜对照药材的用量由原标准的1 g改为0.5 g。原标准及2015年版《中国药典（一部）》干姜药材TLC展开剂［2］14使用了毒性较大的苯和三氯甲烷有机试剂，为了遵循绿色环保的理念，经试验比较多个展开系统，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸（20 ∶3 ∶2 ∶0.4）为展开剂分离效果良好、试剂毒性较小，随行阴性样品无干扰，故选用此展开剂系统。本研究中对方法的耐用性进行了考察，使用3种不同品牌的硅胶板展开：Si60（默克化工技术有限公司，批号为HC39961356，规格为10cm×20cm）；硅胶G板（青岛海洋化工厂分厂，批号为20161220，规格为200mm×100mm）；自制硅胶G薄层板，取硅胶G（青岛海洋化工厂，化学纯，批号为20161220）加0.5%羧甲基纤维素钠溶液调配，用手动铺板器铺成厚度为0.25 mm的薄层板，室温晾干，110℃活化1 h，置硅胶干燥器中备用。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，说明方法的专属性、耐用性较好。

3.2 大枣定性鉴别考察

尝试采用2015年版《中国药典（一部）》大枣药材TLC鉴别方法［2］22发现，本制剂中的阴性对照有干扰；由于大枣中主要含有多糖［3］等成分，对供试品的提取方法进行了更换溶剂及水解［4-7］等多次试验，发现供试品溶液不稳定且阴性对照仍有干扰。大枣中含有齐墩果酸等多种有机酸与多种氨基酸类成分［3］，结合本制剂的工艺，经过多方试验，最终选用正丁醇-醋酸-水系统［8］作为展开剂，茚三酮试液为显色剂，显色斑点清晰，稳定性与重复性均良好，阴性无干扰。本研究中对方法的耐用性进行了考察，在上述3种不同硅胶板展开后，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，说明方法专属性、耐用性好。

3.3 6-姜辣素含量测定条件选择

干姜中最主要的辛辣成分为姜辣素，以6-姜辣素含量最大［9］。参考 2015 年版《中国药典 （一部 ）》干姜项下的含量测定项，对处方中干姜的6-姜辣素的含量采用HPLC法进行考察。本研究中对提取溶剂和提取时间进行了考察，试验结果表明，70%乙醇超声提取20 min即可完全提取；并考察了甲醇 - 水（62 ∶38）［10］、甲醇 -水（55 ∶45）［11］和乙腈 -甲醇 -水（40 ∶5 ∶55）3 种流动相，结果发现，6-姜辣素的峰型有拖尾现象，对流动性稍加改进，采用乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（40∶5∶55）流动相，峰型较好，拖尾因子为 1.0。