烟酰胺片含量及有关物质测定方法改进

2019-05-27李志远左文松

中国药业 2019年9期

李志远，刘屹，左文松

（云南省食品药品监督检验研究院，云南昆明 650106）

烟酰胺片（Nicotinamide Tablets）系吡啶衍生物3-吡啶甲酰胺，属于水溶性B族维生素类药物，在体内与核糖、磷酸、腺嘌呤形成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶Ⅰ）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（辅酶Ⅱ），为脂质代谢、组织呼吸的氧化作用和糖原分解所必需，缺乏时会影响细胞的正常呼吸和代谢，进而引起糙皮病；胃肠道易吸收，吸收后分布到全身组织，半衰期（t1／2）约为 45 min，经肝脏代谢，治疗量仅少量以原形自尿排出，但过量服用时排泄量增加。烟酰胺与异烟肼有拮抗作用，长期服用异烟肼时应适当补充烟酰胺；烟酰胺无扩张血管作用，可用于高血压患者。2015年版《中国药典（二部）》收载有薄层色谱（TLC）法测定其有关物质，紫外分光光度（UV）法测定含量［1-2］。高效液相色谱（HPLC）法测定其含量和有关物质也有文献［3-6］报道。本研究中选择2种不同的方法测定烟酰胺片的含量及有关物质，为该药的质量控制提供更加简便、准确、高效的评价方法［7-9］。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：LC-20A型高效液相色谱仪（PDA检测器，日本岛津公司）；BP-221S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；UE06SFD（6 L）型超声波提取仪（德国Wiggens仪器公司）；UV-2550型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；DELTA320型酸度计（梅特勒-托利多集团公司）。

试药：烟酰胺片（广州康和药业有限公司5批，天津力生制药股份有限公司36批，上海信谊药厂有限公司委托上海信谊黄河制药有限公司32批）；烟酰胺对照品（批号为 100115-200703）、烟酸对照品（批号为100434-201102）均购于中国食品药品检定研究院；N-羟甲基烟酰胺（批号为1001062150）、3-氰基吡啶（批号为13082202）均购于Sigma-Aldrich公司；甲醇为色谱纯；盐酸为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：UITimate XB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0.05 mol／L 醋酸铵溶液（pH 6.0）（20∶80）；检测波长：262nm；柱温：30℃；流速：1.0mL／min；进样量：20 μL。

图1 系统适性用试验高效液相色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 溶液制备

称取烟酰胺对照品适量，精密称定，加流动相适量，超声10 min溶解，并稀释制成质量浓度为250 μg／mL的对照品贮备溶液。称取烟酰胺片细粉适量，精密称定，加流动相适量，超声10 min溶解，并稀释制成质量浓度为50 μg ／mL 的溶液，摇匀，用 0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取烟酰胺片处方项下的辅料适量，加流动相适量，按供试品溶液制备方法制备，即得空白辅料溶液。

2.2.2 方法学考察

系统适用性试验：取 2.2.1项下3种溶液，各精密量取20 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。结果空白辅料溶液无干扰。详见图1。

线性关系考察：精密量取对照品贮备溶液，加流动相制成 250，100，50，25，10 μg ／mL 的溶液，按拟订色谱条件注入液相色谱仪，记录峰面积，以对照品质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝25446X+45667，r＝0.9998（n＝5）。结果表明，烟酰胺质量浓度在10～250 μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2.1项下对照品溶液（质量浓度为 50 μg／mL），连续进样 5 次，记录图峰面积。结果的RSD为0.03%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：称取样品（天津力生制药股份有限公司，批号为1305004）细粉适量，精密称定，依法制备供试品溶液，分别于 0，2，4，6，9，12，18，24 h 时进样，记录峰面积。结果的RSD为0.63%（n＝8），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取样品（天津力生制药股份有限公司，批号为1305004）细粉适量（约相当于烟酰胺50 mg）6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，计算含量。结果烟酰胺平均含量为97.72%，RSD为0.87%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（天津力生制药股份有限公司，批号为1305004）10片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于烟酰胺50 mg），置100 mL容量瓶中，加流动相适量，超声10 min溶解，并稀释至刻度，摇匀，滤过，并精密量取续滤液10 mL置50 mL容量瓶中，稀释至刻度，得100 μg／mL的供试品贮备溶液。精密量取供试品贮备溶液与2.1项下对照品溶液（质量浓度为100 μg ／mL）适量，用流动相稀释成 80% ，100% ，120%回收率试验溶液，摇匀，即得。取上述溶液各20μL，按拟订色谱条件试验，记录峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 烟酰胺加样回收试验结果（n＝9）

定量限确定：按照信噪比（S／N）＝10时，记录色谱图，计算得烟酰胺的定量限为1.08 ng。

2.2.3 样品含量测定

取不同厂家不同批号烟酰胺片73批，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件及2015年版《中国药典（二部）》该品种项下方法（UV法）测定并计算。结果见表2，两组数据比较无显著差异（t＝0.79，P＞0.05）。

2.3 有关物质测定

2.3.1 系统分离度试验

精密称取烟酰胺对照品、烟酸对照品、N-羟甲基烟酰胺、3-氰基吡啶，加甲醇 -水（2 ∶8）制成 50 μg／mL 的混合对照品溶液，精密量取其续滤液20 μL，按拟订色谱条件注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，烟酰胺与其他各杂质分离良好。色谱图见图2。

2.3.2 破坏试验

称取样品（天津力生制药股份有限公司，批号为1305004）粉末适量（约相当于烟酰胺25 mg），精密称定，置 50 mL 容量瓶中，分别在酸（0.1 mol／L HCL）、碱（0.1 mol／L NaOH）、高温（100 ℃水浴 5 h）、氧化（加 3%H2O2溶液 5 mL，室温放置 2 d）、光照（4 500 lx）条件下分别进行破坏性试验。取破坏性试验样品适量，精密称定，依法制备供试品溶液，精密量取适量，按拟订色谱条件注入液相色谱仪，依法测定，记录色谱图，计算含量。结果见表3及图3。可见，烟酰胺在光照条件下最稳定，酸性条件、氧化条件和高温条件下次之，碱性条件下最不稳定。

表2 《中国药典》UV法与HPLC法测定结果（标示量的百分含量，%）

图2 系统分离度试验高效液相色谱图

表3 各破坏条件下烟酰胺片总杂质含量变化情况（%）

2.3.3 辅料干扰试验

图3 破坏试验高效液相色谱图

由烟酰胺片制剂工艺可知，所用辅料主要为淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁。称取上述辅料适量，参照工艺配方加10%甲醇水制得供试品溶液，精密量取20 μL，注入液相色谱仪，依法测定，记录色谱图。结果辅料基本无干扰。

2.3.4 检出限与定量限确定

以信噪比（S／N）＝3时为检出限，以S／N＝10时为定量限，各组分的检出限及定量限确定结果见表4。

表4 检出限与定量限确定结果（ng）

2.3.5 耐用性试验

其他色谱条件不变，改变流速分别为 0.8，1.0，1.2 mL ／min；改变流动相 pH 分别为 5.8，6.0，6.2；改变柱温为25，30，35℃；改变色谱柱为UITimate XB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），Kromasil 100-5 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），AlltimaTMC18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。依法测定，结果显示，各杂质峰之间的分离度良好，保留时间有改变，说明方法耐用性好。

2.3.6 样品有关物质测定

取不同厂家不同批号的73批烟酰胺片，精密称取适量（相当于烟酰胺25 mg）置50 mL容量瓶中，加甲醇-水（2∶8）溶解并定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。精密量取供试品溶液1 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇-水（1∶9）溶解并定容至刻度，即得自身对照溶液。取上述溶液各20 μL照拟订色谱条件及2015年版《中国药典（二部）》该品种项下有关物质含量测定方法进样测定。采用药典方法（TLC法），73批样品的供试品溶液中均未见杂质斑点；采用新建的HPLC法均能检出烟酸，绝大部分样品检出其他杂质。表明新建HPLC法不但能有高效、快捷地区分样品间杂质谱的差异，还能对各杂质进行定量。结果见表5。