人绒毛膜癌JAR细胞裸鼠移植瘤模型的建立及其生物学特性的研究*

崔 莹，刘 镭，许 倩，鲁艳杰，李玉红，范文静

（承德医学院，河北承德 067000）

绒毛膜癌（简称绒癌）为滋养细胞肿瘤(GTN)，是细胞滋养细胞、合体滋养细胞和中间型滋养细胞混合增生的一种恶性肿瘤[1]。50%的绒癌患者继发于完全葡萄胎，还可继发于非葡萄胎性流产、足月妊娠，偶见继发于部分性葡萄胎患者[2]。绒癌不但发病率高，且早期即可发生血道转移，虽然目前临床上通过化疗辅以手术治疗能明显提高患者的生存率，但仍有部分患者由于化疗药物耐药或不耐受化疗药物的毒副作用，预后较差[3]。因此，探讨绒癌的发病机制，提高患者生存率成为亟待解决的临床问题。本研究通过在裸鼠皮下注射绒癌JAR细胞构建绒癌裸鼠移植瘤模型，为进一步研究绒癌的发病机制提供了可靠的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人绒癌细胞系JAR，广州吉妮欧公司购置。

1.1.2 实验动物：SPF级雌性Balb/c裸鼠12只，5～6周龄，体重13～17g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK(京)2016-0006。裸鼠饲养于承德医学院实验动物中心屏障环境，适应性饲养1周后开始实验。

1.1.3 主要试剂及仪器：胎牛血清、DMEM、PBS磷酸盐缓冲液、0.25%胰蛋白酶，美国Gibco BRL公司；UltraSensitiveTMS-P试剂盒、鼠抗人绒毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotropin，β-HCG）抗体、DAB显色试剂盒，福州迈新生物技术开发有限公司；小鼠β-HCG ELISA试剂盒，武汉基因美生物科技有限公司。细胞培养箱、低温高速离心机，美国赛默飞世尔科技有限公司；CKX41倒置显微镜，日本Olympus公司；培养皿，美国Corning公司；1ml一次性使用无菌注射器，江苏治宇医疗器材有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及细胞悬液的制备：JAR细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞生长融合至70%～80%时加入0.25% EDTA消化，无血清培养基DMEM终止消化并制备细胞悬液，离心后重悬于无血清DMEM中，计数并调整细胞密度为5×107个/ml。

1.2.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立：12只Balb/c雌性裸鼠，随机选取其中的8只为模型组，另4只为正常对照组。无菌环境下操作，1ml注射器吸取JAR细胞悬液，每只裸鼠在右侧股背处皮下注射0.2ml的JAR细胞悬液（含细胞数1×107）；正常对照组裸鼠于相同部位注射0.2ml生理盐水。

1.2.3 移植瘤一般特性及裸鼠生长情况观察：观察皮下注射细胞的吸收情况，触摸注射部位是否有肿物形成，以及裸鼠进食、摄水、对外界刺激情况、精神状态和生存状态。间日测量裸鼠体重，以及肿瘤的长径（a）和短径（b），根据公式V=1/2（ab2）计算肿瘤体积。以生长时间和肿瘤体积分别为X轴和Y轴绘制肿瘤体积生长曲线，待肿瘤体积达到0.5cm3时，视为造模成功。

1.2.4 移植瘤、主要脏器大体形态观察及HE染色观察：正常对照组和模型组分别在裸鼠注射生理盐水后第30天和濒死状态时摘眼球取血后处死，取肿瘤组织，以及裸鼠的肺、肾、心、肝、脑、卵巢等绒癌易转移脏器，取材时观察肿瘤组织的质地、活动度、血管浸润及有无脏器转移情况。肿瘤组织及各脏器用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，片厚4μm，行HE染色。

1.2.5 检测血清β-HCG的含量：所取血液4℃、3000rpm、10min离心收集上层血清，采用ELISA法测血清β-HCG的含量。

1.2.6 免疫组织化学法检测移植瘤组织β-HCG的表达情况：采用免疫组化SP法，按照试剂盒说明书操作，检测肿瘤组织β-HCG的表达情况。以小鼠抗β-HCG抗体为一抗，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 统计分析 数据分析使用SPSS 19.0软件，组间计量资料的比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 移植瘤一般特性 本研究中模型组8只裸鼠全部成瘤，成瘤率为100%。

JAR细胞悬液接种后在注射部位形成小皮丘，24h内即可吸收。细胞悬液吸收后，注射部位初起为小米粒样结节，活动度良好，4～7天内结节周围有炎性水肿出现，最终形成圆形、椭圆形、分叶状或结节状肿块。潜伏期最短在注射后第3天可触及皮下肿物，最长为第9天，平均潜伏期为（4.88±2.42）天。

图1 破溃出血的移植瘤

随着肿块直径的增大，肿块处颜色由肤色逐渐加深变为蓝紫色、紫色。当肿块直径达到2.0cm左右时，肿块易破溃出血（图1），实验过程中及时用碘伏消毒。第13天左右时，肿瘤体积生长迅速，平均达到3cm3（图2）。

图2 移植瘤体积增长曲线

2.2 裸鼠生长情况 裸鼠注射JAR细胞悬液后，进食、饮水正常，体重逐渐下降且伴随波动变化（图3）。随着肿块的增大，皮肤褶皱增多，全身肤色由淡粉色转变为淡灰色，逐渐失去光泽。到后期小鼠出现恶液质，进食、饮水减少，消瘦，对外界刺激反应不灵敏。濒死时，皮肤发凉，肤色灰，弓背。裸鼠带瘤生存最短19天、最长30天，平均（24.75±3.41）天。

2.3 大体观察及HE染色结果 取材时可见注射处形成紫红色瘤体，呈圆形、椭圆形、分叶状或结节状，表面光滑覆有包膜，与周围边界清晰，活动度较好；瘤体周围有新生血管形成，剖面有出血坏死。全身脏器无肉眼可见转移。

移植瘤组织HE染色光镜下可见大量增生的滋养细胞，有出血坏死，可见红细胞，出血坏死严重时仅在周围看到残存的癌细胞；肿瘤组织中细胞异型性明显，细胞形态、大小不一，呈圆形、卵圆形；肿瘤细胞核体积增大，核浆比增大，接近1：1，胞核着色加深，染色质呈颗粒状（图4）。肺、肾、心、肝、脑、卵巢等绒癌易转移脏器HE染色镜下未见转移癌细胞。

图3 移植瘤小鼠体重变化曲线

图4 移植瘤组织HE染色结果（×400）

2.4 裸鼠血清β-HCG水平 与正常对照组裸鼠血清β-HCG水平（4.57±1.31）ng/ml比较，模型组裸鼠血清β-HCG的水平（7.11±2.47）ng/ml明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 免疫组织化学染色结果 模型组绒癌JAR细胞移植瘤组织中β-HCG主要在绒癌细胞的胞质中表达，呈棕黄色或褐色颗粒（图5）。

图5 免疫组化染色结果（×400）

3 讨论

裸鼠作为肿瘤研究实验动物的主要选择，在研究肿瘤的分子机制、抗肿瘤药物的开发及药物的敏感性中发挥着重要作用[4]。目前，以裸鼠为宿主动物的肿瘤模型，按照移植部位可以分为皮下移植瘤模型、原位移植瘤模型、腹腔移植瘤模型和异位移植瘤模型[5]。其中皮下移植瘤模型是肿瘤研究中最常用的，具有成瘤率高、易操作、肿瘤体积易测量等优点[6]。本研究应用绒癌JAR细胞系建立了裸鼠皮下移植瘤模型，成瘤率为100%，成瘤率高；形成皮下移植瘤的潜伏期平均为（4.88±2.42）天，成瘤周期较短；并且，移植瘤模型容易建立，实验操作简单，通过培养细胞皮下注射即能完成操作，不需要对裸鼠做过多前期处理；同时，移植瘤生长在皮下便于观察和测量。

人绒毛膜促性腺激素（HCG）是一种由α和β亚基构成的糖蛋白，也是一种主要的肿瘤标志物，它具有多种临床作用，在妊娠和妊娠相关疾病的诊断及肿瘤的监测中发挥重要作用[7]，通过检测人HCG的水平可对滋养细胞肿瘤进行临床治疗的评估[8]。HCG在滋养细胞肿瘤中有表达，且在绒癌中表达较高。本研究采用免疫组织化学和血清学方法检测β-HCG，也证实了这一点，免疫组织化学染色发现绒癌移植瘤组织β-HCG有较强阳性表达，血清学检测模型组裸鼠血清β-HCG水平明显高于正常对照组，并且，HE染色镜下观察发现移植瘤组织中有大量增生的滋养细胞。上述结果均提示本研究建立的绒癌裸鼠移植瘤模型符合绒癌的生物学特性，并保留了绒癌的血清学和组织病理学特点。

总之，本研究成功构建了成瘤率高、周期短、易操作的绒癌裸鼠皮下移植瘤模型，为进一步研究绒癌的发病机制，发现新的预防性或治疗性抗绒癌药物提供了依据。