博耶和科恩重组质粒转化实验所证明的生物学内涵

刘红蕾 聂刘旺

（安徽师范大学生命科学学院 安徽芜湖 241000）

2018年全国高考卷Ⅰ第38 题是一道选做题，分值为15 分，其中的第1 小题：博耶和科恩将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。 该研究除证明了质粒可以作为载体外， 还证明了__________ （答出2 点即可）。 该题的标准答案是：体外重组质粒可进入受体细胞并表达（4 分，其他合理答案可酌情给分）。

博耶（H. Boyer）和科恩（S. Cohen）是现代基因工程的重要奠基者， 在他们之前还有一批科学家同样为基因工程的发展奠定了基础。 1972年，美国斯坦福大学Berg 博士领导的研究小组， 第1次成功地在体外将猿猴病毒SV40 的DNA 和λ 噬菌体的DNA 分别进行酶切， 再用连接酶将其重组，结果获得了杂合DNA 分子［1］。 这给生命科学研究者带来了巨大的启发， 不同来源的原核生物DNA 片断可在体外重组得到杂合DNA 分子。 随后，在1973年，斯坦福大学的Cohen 等［1］也成功地进行了另一个体外重组实验， 并实现了细菌间性状的转移。这表明原核生物的DNA 不仅可在体外重组，甚至重组后的DNA 分子仍然可在大肠杆菌中繁殖。自此，基因工程在1973年正式问世。但是仅在原核生物中被实验证明可实现。一年后，科恩和博耶进行了这道题中所描述的实验， 即将真核生物的基因转移到原核细胞， 并实现功能的表达。这一结果，极大冲击了人们对生物种间界限的传统认识， 而这一结果又能够说明什么生物学内涵？这道高考题正是以此为背景，要求学生写出该实验所证明的生物学内涵。 笔者归纳总结了上述实验所证明的论点， 以期能给教师在进行这部分内容的教学时提供更多的教学启发， 也帮助学生在学习基因工程这一新兴生物技术时能更好地理解其中的操作原理。

1 重组质粒可进入受体细胞

质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA 之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA 分子［2］。 它在很多原核细胞中都存在，自然状态下可在原核细胞内自我复制。 由于质粒上有一个至多个限制酶的酶切位点，因此，可将外源基因导入至质粒中， 再由质粒运载至原核细胞中。博耶和科恩进行的体外转化实验，说明非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后仍可导入大肠杆菌， 且可以像在自然状态下一样进行自我复制或整合至染色体DNA 上， 并随染色体DNA 进行转录和翻译，最终表达。 该实验说明在基因工程中，质粒可作为运载体。

在进行体外转化实验时， 通常都是利用质粒作为载体的。 其优势不言而喻，主要表现为：

1）质粒具有自我复制的能力。 当外源基因导入质粒后，质粒进入受体细胞可独立自我复制，不受拟核染色体DNA 复制的影响，即具有自身的复制原点。

2）质粒不会对受体细胞造成伤害。 质粒本身就是细胞内的遗传物质， 对于细胞而言不属于外来物，因此，不会对受体细胞造成伤害。

3）质粒DNA 分子上有一个至多个限制酶切割位点。 质粒可被限制酶切割开，供外源DNA 片断（基因）插入其中。

4）质粒DNA 分子上有特殊的标记基因。当重组质粒进入受体细胞，需要对重组DNA 进行鉴定和选择， 标记基因即可帮助人们挑选出符合要求的细胞， 例如常用的四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因等。

2 真核生物基因可在原核细胞中表达并实现物种间的基因交流

真核生物和原核生物遗传信息的储存方式是不同的， 真核生物的遗传信息储存在细胞核中的染色体DNA 上，而原核生物则是储存在拟核中的染色体DNA 上，且不同物种的基因在自然状态下相对较难进行交流和融合， 但通过人工改造的方式，摒弃生物有性繁殖的基因交流方式，改为人工操作的无性繁殖即可有效提高不同物种之间基因交流的成功率。在博耶和科恩进行的实验中，非洲爪蟾核糖体蛋白基因就是真核细胞中控制蛋白质合成的基因， 而大肠杆菌是最常见的原核受体细胞，最终基因可表达，说明已实现了爪蟾与大肠杆菌间的基因交流。

因为原核生物大多具有体积小、繁殖快、多为单细胞生物且遗传物质较少等特点，因此，常被用于真核生物体外转化实验的受体细胞。 基因工程也正是利用真核细胞的遗传物质可在原核细胞中表达这一事实，大量生产人类所需要的，但在正常细胞代谢中产量很低的多肽。 可利用原核生物生产大量的基因工程药物， 为更多的疑难杂症患者带来康复的希望， 例如白血病在20 世纪40年代之前一直被认为是不治之症， 但现代基因工程技术则给白血病患者带来康复的希望， 最早研制出的抗CD33 抗体为鼠源性IgG2 抗体-M195，可治疗急性髓性白血病，但由于人会对此产生抗鼠抗体反应而限制了其临床应用。现在可利用基因工程使鼠源性IgG2 抗体－M195 的恒定区序列（即抗体分子的轻链和重链中靠近C 端相对稳定的氨基酸序列）被人源序列所取代，成为人源化的M195－HuM195，然后利用原核生物大量生产，使得更多患者有康复的可能［3］。 还有人们很熟悉的治疗糖尿病的胰岛素，于1978年9月由美国基因工程技术公司研制。通过在细菌体内植入胰岛素基因，人类从此不再需要从猪、牛等动物体内获取胰岛素。 这不仅开启了生物工程药物的新纪元，也给全世界糖尿病患者带来了福音，具体应用过程如图1。

图1 利用基因工程合成胰岛素过程示意图

3 几乎所有生物都共用一套遗传密码子

在细胞中将mRNA 翻译为蛋白质的过程中，碱基与氨基酸之间是通过密码子配对的，mRNA上3 个相邻的碱基决定了1 个氨基酸， 这3 个碱基就是1 个密码子。 该实验中非洲爪蟾的基因能在大肠杆菌中表达， 说明非洲爪蟾和大肠杆菌是共用一套密码子的。通过大量的科学实验证明，目前大多数生物使用的密码子具有通用性， 但也发现极少数例外。 在支原体中，终止密码子UGA 被用于编码色氨酸；在四膜虫（Tetrahymena）及草履虫（Paramecium）等一些纤毛虫中,UGA 是唯一的终止密码子，UAA 和UAG 编码谷氨酰胺；而在游仆虫的一些基因中，通用终止密码子UGA 不作为终止信号,而是编码半胱氨酸［4］。 此外，在对人、牛及酵母线粒体DNA 序列和结构的研究中，也发现一些密码子使用的特殊情况。线粒体与核DNA 密码子使用情况相应的对比如表1 所示。

表1 线粒体与核DNA 密码子使用情况的比较［5］

由此可见，密码子不仅具有通用性，同时还具有一定的特殊性。 因此在选择受体细胞时应尽量避开使用这些具有特殊密码子的生物， 以免在进行体外转化实验时发生翻译的错乱。 除了某些生物具有特殊的密码子外， 不同物种使用密码子的偏好性也不同， 主要是由于不同的生物携带不同的反密码子tRNA 含量是不同的， 例如在大肠杆菌中， 就发现AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA 和GTC 共8 种稀有密码子。当导入外源基因进行表达时，如果稀有密码子连续出现，则会抑制一些蛋白质的合成，发生翻译的错误［6］。 所以，要想使导入的外源基因成功表达也是需要进行筛选和检测的。

4 生物体内有机大分子的构成都遵循共同的规则

从分子生物学的角度出发， 生物的物质构成其实具有简单原则：

1）所有生物的构成分子种类相似，例如DNA、RNA、蛋白质、糖等，都是以碳原子为核心，且通过共价键的形式与其他一些原子构成， 本质上可以说是相通的。

2）构成生物大分子的单体也几乎都一致。 蛋白质分子都是由大约20 种氨基酸通过脱水缩合、盘曲折叠形成的，DNA 都是由4 种脱氧核糖核苷酸形成，RNA 也都是由4 种核糖核苷酸形成的。

因此，在进行基因工程操作时，外源基因导入受体细胞后，DNA 的复制和转录能利用受体细胞中游离的核苷酸， 翻译过程也可利用受体细胞中游离的氨基酸。 此过程并不会因为原料的差异或构成方式的不同导致外源基因无法表达。

通过这样一个简单的体外转化实验， 人们不仅能证明重组质粒可进入受体细胞、 真核生物基因可在原核细胞中表达， 并实现物种间的基因交流，以及几乎所有生物都共用一套遗传密码子，同时， 也能从分子层面证明生物体内有机大分子的构成都遵循共同的规则。

《普通高中生物学课程标准（2017年版）》明确提出现阶段的高中生物学教学要以培养学生的生命观念、 科学思维、 科学探究和社会责任为目标。 教师更应注重教材概念或科学实验等背后所蕴含的生物学原理，让学生知其然，知其所以然。通过一道高考题便能带来如此多的思考， 教材中还有诸多值得深思的内容等待教师带领学生进行探索发现。