樟芝提取物Fr.3抑制TGF-β1诱导的肝纤维化机制

孙 青 ， 耿 燕 *， 杜 妍 ， 许正宏 ，2

（1.江南大学 药学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122）

樟芝（Antrodia camphorata），俗称牛樟菇、牛樟芝、红樟芝等，属于担子菌纲、非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌属，是一种仅寄生于台湾牛樟树腐朽树干内的珍稀药食用真菌，素有“台湾森林之红宝石”、“灵芝之王”之美誉[1]。在台湾民间，樟芝被用来解酒保肝已有悠久历史，且国内外药理实验表明，樟芝菌丝体及发酵液具有抗肿瘤[2]、抗炎[3]、保肝[4-5]等多种活性。樟芝成分复杂，含有多糖类、三萜类、酚类及琥珀酸类等物质。据文献报道，樟芝中的三萜类物质Antcin K可显著抑制肝癌细胞的粘附、迁移、侵袭[6]、琥珀酸衍生物Antrodin B具有抗肝纤维化活性[7-8]、Antrodin C具有抗乳腺癌活性[9]。因此，樟芝具有良好的研究价值及应用前景，尤其是在肝病治疗上。

肝脏是机体重要的器官，具有物质代谢、生物转化、解毒等功能，在受到各种致病因素和刺激因子的侵袭后发生肝脏损伤和炎症反应。肝脏在遭受持续性损伤时会反复自我修复进而形成肝纤维化，主要特征为肝星状细胞（HSCs）的激活以及细胞外基质（ECM）异常积累，特征标志为平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。静息状态的HSCs是存储脂滴和维生素A的主要场所，在活化时脂滴丢失，HSCs分泌大量的胶原（I，III，IV 型）、纤维连接蛋白（Fn）、透明质酸等[10]。TGF-β1是刺激肝星状细胞激活进而发生增值和分化的重要细胞因子之一，可以上调α-SMA和ECM的表达水平[11-13]。TGF-β1可以激活多个信号通路，参与肝纤维化的发生，如Smad、PI3K、MAPK信号通路，调节肝星状细胞的激活、增值、迁移以及凋亡[14-16]。我国是一个肝病高发国家，积极防治肝纤维化能有效降低肝硬化及肝癌发病率。

本课题组前期从樟芝菌体正己烷提取物中经硅胶柱层析分离得到 5 个组分（Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4和Fr.5），并发现Fr.2组分能有效抑制PDGF-BB诱导的肝纤维化[7]，课题组随后对Fr.2组分做了进一步分离及活性分析，发现其抗肝纤维化活性主要来自化合物Antrodin B[8]。作者主要对Fr.3组分抑制TGF-β1诱导的肝纤维化活性进行了研究，同时通过检测ECM的表达及其相关信号通路中蛋白质表达水平的变化来探究作用机制，为樟芝抗肝纤维化的进一步研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验器材

1.1.1 材料与试剂 大鼠肝星状细胞CFSC-8B：购自中南大学湘雅中心实验室细胞库；TGF-β1：购自美国PeproTech公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）：购自美国Gibco公司；胰酶-EDTA消化液、青霉素-链霉素 （100×）、10%SDS、pH 8.8 的 1.5 mol/L Tris-HCl、pH 6.8 的 1 mol/L Tris-HCl： 购自碧云天公司；MTT及SB431542[8]：购自美国Sigma公司；WST-1 细胞增殖试剂盒、Trizol、FastStart Universal SYBR Green Master、细胞裂解液：购自美国Roche公司；MAPK信号通路中抗体、p-AKT及p-Smad2抗体：购自Cell Signaling Technology公司；Collagen I抗体：购自Abcam公司；α-Actin抗体：购自Santa Cruz公司；其他试剂购自国药集团化学有限公司。樟芝菌粉中物质提取方法见文献[7]。

1.1.2 仪器 旋转蒸发仪：德国Heidolph公司；中低压柱层析：Grace公司；Multiskan MK3型酶标仪：德国 Eppendorf公司；CO2细胞培养箱：Thermo公司；倒置显微镜：Nikon公司；RT-PCR仪、化学发光成像仪：Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Fr.3组分的制备方法 3 L烧杯中加入500 g樟芝菌粉与2.5 L甲醇混合，室温浸提12 h，布氏漏斗过滤，重复浸提3次，收集澄清的滤液，经旋转蒸发仪旋转蒸发得甲醇提取物；800 mL去离子水复溶甲醇提取物，等体积与正己烷混合萃取3次，收集正己烷相，旋转蒸发后得正己烷提取物；利用中低压柱层析仪分离樟芝正己烷提取物，条件为：40 g硅胶柱，流速20 mL/min，检测波长为254 nm，流动相为正己烷、乙酸乙酯梯度洗脱，在乙酸乙酯洗脱比例为13%时收集馏分并旋转蒸发得组分Fraction 3（Fr.3）。

1.2.2 CFSC-8B细胞培养与传代 培养基：RPMI-1640培养基+含10%胎牛血清 （FBS）+1%抗生素（100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素）。

培养条件：置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

细胞传代：细胞贴壁生长，长至80%～90%时胰酶消化，加培养基终止消化后悬浮细胞，接种传代，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.3 MTT法检测Fr.3组分作用CFSC-8B后细胞活力的影响 胰酶消化对数生长期的细胞后加培养基悬浮，以5×103个/孔的细胞密度铺于96孔板，每孔100 μL，24 h后换含有不同质量浓度Fr.3组分（0、5、10、20 μg/mL）的培养基作用细胞 24 h，每组6个平行，弃去培养液，随后每孔加入含0.5 mg/mL MTT 的培养基 100 μL，孵育 4 h，弃去废液，每孔再加150 μL DMSO，用酶标仪在570 nm处测OD值[8]。

1.2.4 WST-1法检测Fr.3组分对TGF-β1诱导的CFSC-8B细胞增值 将处于对数生长期的细胞以5×103个/孔的密度铺于96孔板中培养24 h，用含有体积分数0.5%FBS的培养基同步化细胞24 h，加含不同质量浓度的 Fr.3 组分（0、5、10、20 μg/mL）及SB431542（2 μmol/L）预作用细胞 1 h，换含有不同质量浓度的Fr.3组分，SB431542及TGF-β1培养基共同孵育24 h，每孔加入10 μL WST-1培养1 h，用酶标仪在450 nm处测OD值。

1.2.5 细胞小室迁移实验检测Fr.3组分对TGF-β1诱导的CFSC-8细胞迁移 取2×105个/mL的对数生长期细胞悬液100 μL，加入8 μm孔径的聚碳酸酯微孔滤膜Transwell小室（Millipore公司），小室放入预先加有500 μL含10%FBS细胞培养基的24孔板中。孵育4～5 h后，加入不同质量浓度的Fr.3及 SB431542（2 μmol/L）预作用 1 h，换含有不同质量浓度的Fr.3组分、SB431542及TGF-β1培养基继续培养24 h。取出滤膜，用棉签擦去上室内表面细胞，用质量分数4%多聚甲醛固定迁移至滤膜外表面的细胞30 min，质量分数0.1%的结晶紫染色，显微镜拍照，用体积分数33%的醋酸脱色10 min，洗脱液在酶标仪上于570 nm处测定OD值，间接反映细胞数。

1.2.6 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测Fr.3组分对TGF-β1诱导的肝纤维化ECM相关基因的表达采用Trizol法提取细胞总RNA，将RNA逆转录为cDNA，采用SYBR Green进行荧光定量PCR反应，用2-△△t法定量分析ECM相关基因的表达水平。相关基因为：α-SMA、Collagen I （Col1）、Collagen III（Col3）、Fibronectin（Fn）[7]。

1.2.7 蛋白免疫印迹（Western Blotting）法检测Fr.3组分对TGF-β1诱导的相关蛋白的表达的影响 细胞加药作用后，预冷的PBS润洗细胞，每皿加入100 μL蛋白裂解液（含蛋白酶及磷酸酶抑制剂），在冰上裂解30 min，将细胞刮下收集于1.5 mL离心管中，12 000 g，4℃离心 10 min，取蛋白质上清液，BCA试剂盒测样品的蛋白质浓度。经10%的SDSPAGE电泳湿法转膜至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭后，分别孵育一抗和二抗，ECL试剂盒（Thermo）显色拍照，用Image J软件分析蛋白质条带灰度值，定量检测 α-SMA、Col1 以及 Smad、MAPK、PI3K 信号通路相关蛋白质的表达水平。

1.2.8 数据统计 用One-Way ANOVA统计学分析实验结果，每组数据以平均值±标准偏差表示。p＜0.05，与空白对照组相比；极显著水平表示为***p＜0.001；与模型组相比，极显著水平表示为###p＜ 0.001。

2 结果与分析

2.1 Fr.3组分体外抗肝纤维化活性评价

2.1.1 Fr.3组分的制备 樟芝菌粉（500 g）与2.5 L甲醇室温浸提12 h，过滤，重复浸提3次，收集滤液旋转蒸发后得到甲醇提取物，以水复溶至800 mL，与正己烷等体积萃取得正己烷提取物44.36 g。通过硅胶柱层析法分离樟芝正己烷相，在乙酸乙酯洗脱比例为13%时收集馏分得组分Fraction 3（Fr.3）共2.2 g，在樟芝菌粉中的得率为0.64%，Fr.3组分为黄色油状物，溶于甲醇。

2.1.2 Fr.3组分对CFSC-8B细胞活力的影响 将不同质量浓度的 Fr.3 组分（3、6、10、15、20、30、60 μg/mL）与CFSC-8B细胞共孵育24 h，利用MTT方法检测细胞存活率。如图1所示，Fr.3组分在低于20 μg/mL时对CFSC-8B细胞无明显毒性，细胞存活率均在80%以上，但在高质量浓度60 μg/mL的Fr.3作用下，CFSC-8B细胞存活率显著被抑制，抑制率达到72.75%，有明显的毒副作用，Fr.3组分的IC50值为54.56 μg/mL。因此，选择Fr.3组分作用质量浓度在0～20 μg/mL时与CFSC-8B细胞孵育 24 h进行后续研究。

图1 Fr.3对CFSC-8B细胞存活率的影响Fig.1 Effect of Fr.3 on cell viability in CFSC-8B cells

2.1.3 Fr.3组分对TGF-β1诱导的CFSC-8B细胞迁移及细胞增值的影响 Geng等通过实时荧光定量和蛋白免疫印迹法确定TGF-β1活化CFSC-8B细胞的最佳作用质量浓度和时间分别为10 ng/mL和24 h[8]。在此基础上通过WST-1法检测Fr.3组分（0、5、10、20 μg/mL）作用于 TGF-β1 诱导的 CFSC-8B细胞后，其细胞增值活性的变化见图2。TGF-β1显著诱导细胞增值，Fr.3作用后可以显著抑制TGF-β1 诱导的增值作用（###p＜0.001）。

图2 Fr.3组分对TGF-β1诱导的CFSC-8B细胞增值的影响Fig.2 Effects of Fr.3 on TGF-β1 induced cell proliferation in CFSC-8B cells

2.1.4 Fr.3组分对TGF-β1诱导的CFSC-8B细胞迁移影响 通过小室迁移法检测细胞增值，考察Fr.3 组分（0、5、10、20 μg/mL）抗肝纤维化活性，见图3。与空白组相比，TGF-β1诱导后细胞迁移率显著增加（**p＜0.01），Fr.3 组分作用活化的细胞后，显著抑制细胞迁移（##p＜0.01），且具有明显的剂量依赖关系，20 μg/mL Fr.3组分抑制率与阳性药物SB431542抑制率相当。

2.2 Fr.3组分改善TGF-β1诱导的肝纤维化作用机制初步探讨

2.2.1 Fr.3组分下调TGF-β1诱导的肝纤维化细胞ECM中相关基因的表达水平 TGF-β1诱导的肝纤维化细胞活化后，ECM异常积累，在基因水平上，α-SMA、Col1、Col3、Fn 转录水平升高。 采用 qRT-PCR技术进一步检测 Fr.3组分对 TGF-β1诱导的CFSC-8B相关基因表达水平的影响，结果见图4。TGF-β1作用于CFSC-8B细胞后可显著上调α-SMA、Col1、Col3、Fn 基因的表达水平（***p＜0.001）。Fr.3组分作用后显著降低基因的表达 （###p＜0.001），且具有剂量相关性。

图3 Fr.3组分对TGF-β1诱导的CFSC-8B细胞迁移的影响（标尺:100 μm）Fig.3 Effects of Fr.3 on TGF-β1 induced cell migration in CFSC-8B cells（Scale bar，100 μm）

图 4 Fr.3组分对 TGF-β1诱导的 α-SMA、Col1、Col3及Fn mRNA的相对表达量的影响Fig.4 Effect of Fr.3 on the expression of α-SMA，Col1，Col3 and Fn mRNA induced by TGF-β1

2.2.2 Fr.3组分降低TGF-β1诱导的α-SMA、Col1的表达并下调Smad、PI3K、MAPK通路中相关蛋白质磷酸化表达水平 通过Western blotting法检测在TGF-β1的诱导下，不同质量浓度的Fr.3组分作用于CFSC-8B后，ECM中α-SMA、Col1蛋白质表达情况，见图 5（a）。 TGF-β1作用于 CFSC-8B 细胞后可显著诱导α-SMA、Col1的蛋白质表达 （###p＜0.001），而Fr.3组分作用后降低其表达水平（***p＜0.001）。因此，Fr.3组分可以降低TGF-β1诱导的肝星状细胞ECM的积累。

TGF-β1可以介导Smads的信号通路从而影响肝纤维化的发展[17]，如图 5（b）所示，Fr.3组分可以显著抑制TGF-β1介导的Smad信号通路中Smad2的磷酸化表达水平（##p＜0.01）；磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶（PI-3K/AKT）信号通路可通过激活AKT进入肝星状细胞核，调节相关基因的转录水平[18]，如图5（c），Fr.3组分还可以显著抑制 TGF-β1介导的PI3K信号通路中AKT的磷酸化表达水平 （##p＜0.01）；丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK）信号通路由Ras/ERK、JNK/SAPK 和 P38三条途径组成[19]，也是肝纤维化进程中的主要通路之一，如图 5（d）-（e）所示，在MAPK信号通路中，TGF-β1可以显著诱导p-ERK及p-P38蛋白质的表达 （***p＜0.001），Fr.3组分作用后磷酸化表达水平降低 （###p＜0.001），但p-JNK无影响。因此，Fr.3组分通过调控多个TGF-β1诱导的信号通路中的蛋白表达水平抑制肝纤维化。

图 5 Fr.3对TGF-β1诱导的CFSC-8B细胞中α-SMA、Col1、p-Smad2、p-AKT、p-ERK及p-P38及蛋白质表达的影响Fig.5 Effect of Fr.3 on expression of α-SMA，Col1，p-Smad2，p-AKT，p-ERK and p-p38 in CFSC-8B cells stimulated by TGF-β1

3 结 语

Lu等研究表明，樟芝菌粉对乙醇诱导的肝损伤有保护作用[20]，Song等通过建立四氯化碳诱导的大鼠肝损伤模型，证明樟芝发酵液有保肝活性[21]，并且Geng等从樟芝菌粉正己烷提取物中分离出具有抗肝纤维化活性的化合物Antrodin B[8]。有研究表明，肝纤维化是可逆的过程[22]，合理治疗可以逆转肝纤维化的进程，从而达到缓减甚至治愈肝纤维化的目的。抑制HSC的活化，使其从活化状态转变为静息状态，是研究抗肝纤维化药物的重要方向之一。

作者以樟芝菌粉中分离得到Fr.3组分为研究对象，在已建立的TGF-β1诱导的细胞肝纤维化模型上，进行了Fr.3组分体外抗肝纤维化活性及作用机制的研究。研究表明，Fr.3组分可显著抑制TGF-β1诱导的CFSC-8B细胞增值及细胞迁移，质量浓度为 20 μg/mL Fr.3组分与阳性药物 SB431542（2 μg/mL）相比，抑制细胞增值及细胞迁移效果相当；Fr.3组分能有效抑制TGF-β1诱导的CFSC-8B细胞 ECM 中 α-SMA、Col1、Col3、Fn 的基因转录及α-SMA和Col1的蛋白质表达水平。

为研究Fr.3组分抗肝纤维化活性机制，考察了Fr.3组分作用后，对TGF-β1诱导的Smad、MAPK以及PI3K/AKT信号通路中相关磷酸化蛋白质的表达水平的影响。研究表明：Fr.3组分可以显著下调TGF-β1诱导的 Smad2、AKT、ERK 及 p38磷酸化蛋白质表达水平，而Smad、PI3K、MAPK信号通路，与肝星状细胞的激活、增值、迁移等有关[14-16]。综上所述，Fr.3组分通过调控 Smad、PI3K、MAPK信号通路，抑制细胞增值、迁移及ECM的积累，进而抑制肝纤维化。王静等在建立的PDGF-BB诱导的肝纤维化模型基础上，研究了樟芝提取物Fr.2组分通过调控MAPK信号通路的转导来抑制肝纤维化[7]，因此樟芝不同提取物Fr.2、Fr.3组分都能有效抑制肝纤维化细胞的增值、迁移，Fr.2、Fr.3组分可能是通过调控多种信号通路综合作用抑制肝纤维化。

后期需要对樟芝提取物Fr.3组分进一步分离纯化，分析鉴定Fr.3组分中主要活性化合物，并且建立四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型，评价其体内抗肝纤维化活性，同时结合体外细胞模型，研究其抗肝纤维化作用机制，为治疗肝纤维化的研究提供理论依据。