响应面法优化斑点叉尾鮰鱼内脏油的水酶法提取工艺研究

安徽富煌三珍食品集团有限公司 安徽巢湖 238076

斑点叉尾鮰鱼原产于北美洲，是一种具有重要商业价值的淡水鱼，受到了世界广大消费者的青睐，斑点叉尾鮰鱼肉味鲜美，无肌间刺，主要用于生产鮰鱼片；但是，加工过程中产生大量的包括内脏等下脚料(占原料的40%～55%)，主要用于生产饲料鱼粉，对其中的油脂等营养成分开发程度不高。内脏油脂作为下脚料的重要组成部分之一，大约占了整个鱼体重的10%，具有很大的开发潜力。同时鱼油中含有丰富的EPA、DHA等多不饱和脂肪酸，具有很高的营养价值，可以调节血脂、预防老年痴呆、提高记忆力、提高免疫力等[1～3]。

传统的鱼油提取工艺中的溶剂萃取法、蒸煮法具有提取率低的缺点、淡碱水解法具有提取过程不易控制，提取率不稳定的缺点，而酶解法提油具有提取率高、反应条件稳定、有效成分损失少等优点[4]。

本文在酶解法提油工艺基础上进行改进，采用水酶法对斑点叉尾鮰鱼内脏油进行提取，通过响应面法优化了对斑点叉尾鮰鱼内脏油提取的工艺条件，最终得出了水酶法提油最佳的工艺参数，为斑点叉尾鮰鱼的综合利用及产业化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料与试剂

斑点叉尾鮰鱼内脏：安徽富煌三珍公司提供，实验前去胆去鰾清洗干净后用组织捣碎机打碎匀浆，冷藏备用。

酶制剂：木瓜蛋白酶(标注活力80万U/g)，南宁庞博生物工程有限公司。

L-酪氨酸：上海康捷生物科技发展有限公司。

酪蛋白：北京奥博星生物技术有限责任公司。

三氯乙酸(AR)：国药集团化学试剂有限公司。

氢氧化钠(AR)：汕头市西陇化工厂有限公司。

盐酸(AR)：上海振企化学试剂有限公司。

高纯氮气：合肥众益化工产品有限责任公司。

1.1.2 主要仪器与设备

TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

B11-2型数显恒温磁力搅拌器：上海司乐仪器有限公司。

AL204-IC分析天平:梅特勒托利多仪器(上海)有限公司。

PHS-3C精密PH计：上海大普仪器有限公司。

FSH-2A可调高速匀浆机：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

卧式冷冻冷藏可转换冷柜：广州市穗凌电器有限公司。

TGL-16C高速离心机：安亭科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水酶法提油工艺流程[5]

原料→清理、匀浆→调液料比→调pH→加酶→保温酶解→离心→粗鱼油。

将去胆囊、鱼鰾及肠内杂质并清洗干净的斑点叉尾鮰鱼内脏原料解冻后，然后用组织捣碎机将内脏捣碎，加水调整液料比(mL/g),用4mol/L的NaOH或HCL调解酶解液的初始pH值，加入一定量的木瓜蛋白酶，一定温度下，恒温水解一段时间，趁热在5 000g的离心力下离心10min，分离出上层鱼油。

根据下式计算鱼油提取率：

注：原料中鱼油质量测定按照《GB5009.6-2016食品安全国家标准食品中脂肪的测定》的方法进行；鱼油提油率下述简称“提油率”。

1.2.2 木瓜蛋白酶活性的测定

参照黄春喜等(2012)[6]，zhen-xingtang等(2006)[7]测定木瓜蛋白酶活性。

1.2.3 单因素试验设计

以提油率为评价指标，研究不同的液料比、加酶量、酶解pH、温度、时间对斑点叉尾鮰鱼内脏油提油率的影响。

1.2.4 响应面试验设计

根据单因素试验结果，以提油率为指标，利用Design-Expert软件进行响应面试验设计，因素水平见表1。

表1 Box-Behnken实验因素水平表

1.3 数据分析

采用SPSS软件的one-way ANOVA 和TuKey多重比较来检验相关数据的差异，当p<0.05时，认为差异显著。采用Design-Expert进行响应面分析，所有数据和图表均以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 水酶法提取斑点叉尾鮰鱼内脏油的单因素分析

2.1.1 液料比对斑点叉尾鮰鱼内脏油提油率的影响

设定pH值7.5、加酶量3 000U/g、时间60min、温度60℃，探讨不同液料比(mL/g)(0.25∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)对斑点叉尾鮰鱼内脏油提油率的影响，结果如图1所示。

由图1可知，随着液料比的增加，提油率先增加，后降低，在液料比mL/g为1∶1时，提油率最高。这是由于液料比偏低时，参加反应的底物浓度大，分散性差，可能导致较多的底物聚集在酶的活性中心，降低酶的生化活性；液料比偏高时，反应体系浓度低，不利于反应的进行，而且给后期的离心分离带来了一定的困难，综合考虑，确定最佳的液料比mL/g为1∶1。

2.1.2 加酶量对斑点叉尾鮰鱼内脏油提油率的影响

设定pH值7.5、液料比(mL/g) 1∶1、时间60min、温度60℃，探讨不同加酶量(1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500U/g)对斑点叉尾鮰鱼内脏油提油率的影响，结果如图2所示。

由图2可知，随着加酶量的增加，提油率增加速率由前期显著至后期趋于平稳，在加酶量为3 500U/g时，提油率增速趋于平稳。这是由于随着加酶量的增加，底物浓度逐渐趋于饱和的缘故，综合考虑生产成本和反应速率等因素，初步确定最佳的加酶量为3 500U/g。

2.1.3 pH值对斑点叉尾鮰鱼内脏油提油率的影响

设定加酶量3 500U/g、液料比(mL/g) 1∶1、时间60min、温度60℃，探讨不同pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)对斑点叉尾鮰鱼内脏油提油率的影响，结果如图3所示。

由图3可知，随着pH值的增加，提油率先增加后降低，pH值7.0时，提油率最高。这是因为各种酶在一定的条件下都有其最适宜的pH值，pH值偏高或偏低都会造成酶解效果下降。因此，在本试验给定的条件下，初步确定最佳的pH值为7.0。

2.1.4 温度对斑点叉尾鮰鱼内脏油提油率的影响

设定加酶量3 500U/g、液料比(mL/g) 1∶1、时间60min、pH值7.0，探讨不同温度(40、45、50、55、60、65、70、75、80℃)对斑点叉尾鮰鱼内脏油提油率的影响，结果如图4所示。

由图4可知，随着温度的增加，提油率先增加后降低，温度60℃时，提油率最高。这是因为在一定温度范围内随着温度的升高，酶活性增强；但是温度过高时，会导致蛋白酶变性，造成其反应活性下降。因此，在本试验条件下，初步确定最佳的温度为60℃。

2.1.5 时间对斑点叉尾鮰鱼内脏油提油率的影响

设定加酶量3 500U/g、液料比(mL/g) 1∶1、温度60℃、pH值7.0，探讨不同时间(15、30、60、90、120、150、180min)对斑点叉尾鮰鱼内脏油提油率的影响，结果如图5所示。

由图5可知，随着反应时间的延长，提油率呈现先升高后趋于平稳的趋势。这是由于在一定反应条件下，随着系统反应时间的延长，酶与底物的作用趋于彻底，同时与蛋白结合的油脂也逐渐释放出来；后期增速缓慢主要是因为绝大多数的结合油脂已经释放出来了。考虑到持续加热会导致提取油脂色泽加深及造成不饱和脂肪酸氧化，综合考虑，初步确定最佳的时间为60min。

2.2 响应面结果与分析

利用Design-Expert建立的提油率Y与影响因素之间的二次多项回归模型为：Y=84.77+1.30×A-0.92×B+4.40×C+1.67×D+0.59×A×B+1.35×A×C+0.26×A×D+0.77×B×C-0.78×B×D+2.87×C×D-2.51×A2-0.34×B2-5.27×C2-4.37×D2。

2.2.1 响应面设计及结果

响应面设计及结果详见表2。

2.2.2 响应面曲线图

响应面曲线图详见图6～图11。

组别A温度/℃B加酶量/U·g-1C时间/minDpH值Y提油率/%1654000607.083.41±2.562553500907.078.46±1.123603500607.085.39±0.484553500606.575.86±1.805603000606.577.71±1.426553500607.579.20±0.917554000607.077.62±1.088553500307.073.37±0.859604000606.579.56±1.3810604000907.082.7±1.4311603500906.575.48±1.0312604000307.071.98±2.0813603500607.083.79±1.4914603500307.568.68±1.1915653500607.580.15±0.9216604000607.581.49±0.8517653500606.575.77±1.2018603500907.583.86±1.1219603500306.571.79±0.8120653000607.084.66±0.5521603000307.076.89±0.8622603000907.084.51±1.2323553000607.081.25±1.0324653500907.083.95±0.7925603000607.582.77±0.7526603500607.085.12±0.6227653500307.073.45±1.33

2.2.3 二次多项回归模型方差分析

通过表3的二次多项回归模型方差分析可看出：模型显著性检验极显著(p<0.01)，表明该模型具有统计学意义。自变量一次项A(温度)、C(时间)、D(pH)极显著(P<0.01)、B(加酶量)显著(P<0.05)；二次项CD、A2、C2、D2极显著(p<0.01)。失拟项P值为0.3040>0.05，表明无失拟因素存在，因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。

回归系数R2(0.9339)、校正决定系数R2(0.9219)均大于0.80和变异系数1.67%，进一步表明模型拟合优度较好。

表3 二次多项回归模型方差分析

2.3 最佳提取方案验证

在单因素实验与响应面分析的基础上，通过数学模型优化的最佳提取工艺参数为：时间75.2min、液料比(mL/g) 1∶1、温度61.51℃、pH值7.23、加酶量3 000.06U/g，预测鱼油提取率为87.0%；为便于操作，确定最佳的提取工艺参数为：时间75min、液料比(mL/g) 1∶1、温度61.5℃、pH值7.2、加酶量3 000U/g。在最佳条件下，得到的鱼油提取率为86.34%，结果与预测基本吻合。由此可见响应面法得到的鱼油提取率具有较高的可靠性。

3 结论

在单因素试验的基础上，以鱼油提取率为指标，进行响应面设计及分析，最终得到最佳的提取工艺参数为：时间75min、液料比(mL/g) 1∶1、温度61.5℃、pH值7.2、加酶量3 000U/g，在最佳条件下，得到的鱼油提取率为86.34%。经方差分析得知A(温度)、C(时间)、D(pH)极显著(p<0.01)、B(加酶量)显著(p<0.05)；二次项CD、A2、C2、D2极显著(p<0.01)。验证试验进一步表明，响应面分析方法可以较好地优化斑点叉尾鮰鱼内脏油的水酶法提取工艺，对工业化生产具有一定的指导意义。