妊娠期糖尿病TNF-α与VCAM-1的表达及相关性研究

赵莉莉 杨筱青

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是发生在妊娠期的一种常见病理状态，增加了孕产妇和围生儿并发症的发生率[1]。研究表明妊娠期糖尿病的特征是胰岛素抵抗和与亚临床炎症有关的血管内皮细胞功能障碍，胰岛素是通过血管内皮细胞发挥作用，当血管内皮细胞受损时可引起胰岛素抵抗，发生妊娠期糖尿病[2]。因此，血管内皮细胞损伤在妊娠期糖尿病发病机制中起重要作用。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一种促炎性细胞因子，在体外将TNF-α添加到原代人脐静脉内皮细胞的实验中发现TNF-α可诱导血管内皮细胞功能障碍[3]。血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)是内皮功能障碍的生物标志物[4]。VCAM-1可结合存在于白细胞上的配体，促进白细胞附着于血管内皮细胞，导致血管内皮细胞损伤[5]。目前国内关于TNF-α在GDM的血管内皮细胞损伤发病机制方面还未见文献报道，关于VCAM-1在GDM中的研究甚少。本研究通过测定正常孕妇和妊娠期糖尿病患者血浆、胎盘中TNF-α、VCAM-1的表达，测定所有研究对象血中空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血红蛋白(hemoglobinA1c,HbA1c)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein,LDL-C)、载脂蛋白A(apolipoprotein A, APOA)和载脂蛋白B(apolipoprotein B,APOB)的水平，探讨TNF-α、VCAM-1在妊娠期糖尿病发生、发展中的作用，及与妊娠期糖尿病病情严重程度的相关性，进而为妊娠期糖尿病的治疗方案提供依据。

对象与方法

1.研究对象：选取2015年8月～2016年1月在笔者医院产检和住院分娩的妊娠期糖尿病孕妇50例为GDM组，诊断标准参照第8版《妇产科学》，妊娠期糖尿病的诊断标准：在妊娠24～28周行75g空腹葡萄糖耐量试验，空腹血糖为5.1mmol/L，1h血糖为10.0mmol/L，2h血糖为8.5mmol/L，任意一点的血糖值达到或超过上述标准即可诊断为妊娠期糖尿病。另选取同期在笔者医院产检和住院的无妊娠合并症和并发症的正常孕妇50例为正常组。GDM组患者年龄21～35岁，平均年龄31.5±5.3岁，分娩孕周37.0～41.1周，平均孕周38.5±1.2周，正常组年龄21～35岁，平均年龄28.1±4.2岁，分娩孕周37.0～41.2周，平均孕周38.6±1.3周，均为单胎妊娠。所有研究对象均无妊娠期高血压疾病、心脏病、严重肝、肾疾病，其他内分泌疾病、血液性疾病、胎膜早破和近期感染病史，无酗酒、抽烟和吸毒及应用胰岛素等。

2.标本采集：入院后治疗前抽取空腹静脉血6ml，3ml用于测定血浆TNF-α、VCAM-1的浓度，另外3ml送笔者医院生化检验室测定FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA和APOB。胎盘娩出后15min内收取胎盘母体面近脐带根部直径3cm范围内的组织，约1cm3，进行冲洗、固定、脱水、石蜡包埋等。

3.检验指标：分别记录两组的一般资料，如年龄、分娩孕周、身高、体重、及血压等，并测定两组研究对象血中TNF-α、VCAM-1、FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA及APOB的水平。采用ELISA测定血浆TNF-α、VCAM-1浓度；采用免疫组织化学技术检测TNF-α、VCAM-1的表达并进行图像分析；FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA和APOB等送笔者医院生化检验室测定。

4.主要试剂:人TNF-α酶联免疫试剂盒(中国武汉Elabscience公司)，人VCAM-1酶联免疫试剂盒(中国武汉Elabscience公司)，鼠抗人TNF-α多克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)，兔抗人VCAM-1多克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)。

5.采用双抗体夹心法：应用人TNF-α酶联免疫试剂盒和人VCAM-1酶联免疫试剂盒分别对TNF-α、VCA M-1的浓度进行测定(操作步骤按试剂盒说明书进行)。采用免疫组化法测定胎盘组织中TNF-α、VCAM-1的表达，在光学显微镜下观察胎盘组织，阳性表达是细胞的胞质染色为深棕色颗粒，在镜下选图，Image-pro plus 6.0处理图片，计算吸光度值。

结 果

1.一般资料比较:两组患者的年龄、分娩孕周、身高、体重、收缩压及舒张压比较，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 一般情况比较

2.正常组各指标检测结果:血浆TNF-α浓度平均值1.44±0.50ng/ml，血浆VCAM-1浓度平均值57.45±9.60ng/ml，FBG平均4.29±0.40mmol/L，HbA1c平均5.30%±0.30%，HDL平均2.08±0.40mmol/L，LDL平均2.96±0.50mmol/L，APOA平均2.15±0.30g/L，APOB平均1.18±0.20g/L(表2)。

3.GDM组各指标检测结果：血浆TNF-α浓度平均值1.77±0.50ng/ml，血浆VCAM-1浓度平均值110.82±9.3ng/ml，FBG平均6.50±0.60mmol/L，HbA1c平均5.70%±0.40%，HDL平均1.60±0.30 mmol/L，APOA平均1.94±0.40g/L，LDL平均3.68±0.80mmol/L，APOB平均1.50±0.40g/L(表2)。

4.正常组和GDM组各指标间比较：GDM组血浆中TNF-α、VCAM-1、FBG、HbA1c、LDL、APOB的水平比正常组明显升高(P<0.05)， HDL、APOA水平与正常组比较明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 正常组和GDM 组各指标间比较

与正常组比较，*P<0.05

5.血浆中各指标之间的相关性分析:GDM组血浆中TNF-α与VCAM-1浓度呈正相关(P<0.05)，TNF-α、VCAM-1分别与FBG、HbA1c、LDL、APOB浓度呈正相关(P<0.05)，与HDL、APOA浓度呈负相关(P<0.05)。正常组血浆中TNF-α与VCAM-1的浓度无相关性(P>0.05)，TNF-α、VCAM-1分别与FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA、APOB无相关性(P>0.05，表3)。

表3 血浆中各指标之间的相关性

6.免疫组化结果:TNF-α主要表达于胎盘绒毛滋养细胞和血管内皮细胞上，蜕膜细胞也有表达，定位于细胞质，染色为棕黄色颗粒(图1)。TNF-α在正常组和GDM组的平均吸光度值分别为0.06±0.02、0.12±0.02，GDM组TNF-α的平均吸光度值明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。在GDM组血浆中TNF-α水平与胎盘中TNF-α平均吸光度值呈正相关(r=0.693，P<0.05)。VCAM-1主要表达于胎盘绒毛的合体滋养细胞和血管内皮细胞上，定位于细胞质，染色为棕黄色颗粒(图2)。VCAM-1在正常组和GDM组的平均吸光度值分别为0.04±0.02，0.11±0.02，GDM组VCAM-1的平均吸光度值明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。在GDM组血浆中VCAM-1水平与胎盘中VCAM-1平均吸光度值呈正相关(r=0.617，P<0.05)。GDM组胎盘组织中TNF-α平均吸光度值与VCAM-1平均吸光度值呈正相关(r=0.643，P<0.05)。

图1 TNF-α在正常组和GDM组胎盘组织中的表达(SP，×400)A.正常组；B.GDM组

图2 VCAM-1在正常组和GDM组胎盘组织中的表达(SP,×400)A.正常组；B.GDM组

讨 论

妊娠期糖尿病是在妊娠期间首次发现，是最常见的妊娠并发症之一，GDM可能导致孕妇及其后代产生各种不良后果，如妊娠高血压、剖宫产、早产和巨大儿，以及代谢综合征发展的倾向和2型糖尿病[6]。研究表明妊娠期糖尿病的特征是胰岛素抵抗和与亚临床炎症有关的血管内皮细胞功能障碍，胰岛素是通过血管内皮细胞发挥作用，当血管内皮细胞受损时可引起胰岛素抵抗，发生妊娠期糖尿病[2]。因此，血管内皮细胞损伤在妊娠期糖尿病的发生、发展中起重要作用。

TNF-α是一种由中性粒细胞、单核巨噬细胞、NK细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及血管内皮细胞分泌的细胞因子。妊娠后胎盘组织也可分泌TNF-α。Tu′uhevaha等[3]在体外将TNF-α添加到原代人脐静脉内皮细胞的实验中发现TNF-α可诱导内皮细胞功能障碍。本研究结果表明妊娠期糖尿病患者血浆中TNF-α的浓度与正常组相比明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。这说明TNF-α与妊娠期糖尿病的发病有关，笔者推测TNF-α引起血管内皮损伤后，导致胰岛素抵抗，发生妊娠期糖尿病。同时本研究结果还表明妊娠期糖尿病患者的胎盘组织中TNF-α的表达与正常组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且胎盘中TNF-α的表达与血浆TNF-α水平呈正相关。由此笔者推测胎盘组织中TNF-α表达升高可引起胎盘血管内皮损伤，造成胎盘功能障碍。这说明TNF-α可能通过损伤血管内皮细胞促进妊娠期糖尿病的发生、发展。

VCAM-1是免疫球蛋白基因超家族的成员，主要功能是介导淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞与血管内皮的黏附，它在白细胞-内皮细胞信号转导中起重要作用。VCAM-1是内皮功能障碍的生物标志物[4]。VCAM-1可结合存在于白细胞上的配体，促进白细胞附着于血管内皮细胞，导致血管内皮细胞损伤[5]。研究表明VCAM-1在妊娠期糖尿病及糖尿病合并妊娠中均显著高于正常组，这与本研究结果一致[7，8]。本研究结果显示，正常组孕妇血浆中VCAM-1的浓度比GDM组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。这说明VCAM-1 与妊娠期糖尿病的发病密切相关，可以推测当VCAM-1损伤血管内皮后，引起胰岛素抵抗，导致妊娠期糖尿病的发生。同时本研究结果还表明正常组孕妇胎盘组织中VCAM-1的表达比GDM组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，并且在GDM组中，胎盘中VCAM-1的表达与血浆VCAM-1的水平呈正相关，由此可以推测妊娠期糖尿病患者中高表达的VCAM-1可以损伤胎盘血管内皮细胞及滋养层细胞，造成胎盘功能障碍，进而引起胎儿缺血、缺氧，增加死胎的发生风险。这也说明了VCAM-1可能通过损伤血管内皮细胞促进妊娠期糖尿病的发生、发展。

Di Fulvio等[9]研究结果表明，在人脐静脉内皮细胞内TNF-α能刺激ICAM-1、VCAM-1的表达，导致血管通透性增加和血管炎性反应，促进内皮细胞功能损伤，提示妊娠期糖尿病与炎性因子的过度表达和血管性白细胞黏附分子表达增高有关，两者都可导致血管内皮功能障碍和血管疾病，加重胎盘的缺血、缺氧状态。本研究结果表明，正常组血浆中TNF-α与VCAM-1的浓度无相关性(P>0.05)，而GDM组血浆中TNF-α与VCAM-1浓度呈正相关(P<0.05)；正常组胎盘组织中TNF-α平均吸光度值与VCAM-1平均吸光度值无相关性(P>0.05)，而GDM组胎盘组织中TNF-α平均吸光度值与VCAM-1平均吸光度值呈正相关(P<0.05)。说明TNF-α作为炎性细胞因子，同时刺激VCAM-1的表达，两者共同导致血管内皮细胞损伤，协同促进了妊娠期糖尿病的发生、发展。

本研究结果表明，GDM组血浆中FBG、HbA1c的浓度明显高于正常组(P<0.05)，且GDM组血浆中TNF-α、VCAM-1分别与FBG、HbA1c浓度呈明显正相关(P<0.05)，而正常组血浆中TNF-α、VCAM-1分别与FBG、HbA1c浓度无相关性(P>0.05)，说明TNF-α、VCAM-1在一定程度上反映了妊娠期糖尿病的严重程度。

妊娠期的脂质代谢异常与妊娠期糖尿病的发生有关，是导致不良妊娠结局的重要危险因素。HDL和LDL是脂代谢变化的指标，APOA是HDL的主要载脂蛋白，APOB是LDL的主要载脂蛋白。妊娠期相对较低的HDL与GDM和巨大儿发生显著相关; 而相对较高的HDL是两者的保护因素[10]。研究发现GDM组中LDL明显高于对照组，HDL明显低于对照组，研究还发现LDL亚型表型B与GDM风险增加4倍相关。Leiva等[11]研究发现孕妇血浆中LDL浓度随孕周增加而升高，可能导致胎儿胎盘血管内皮功能的改变。本实验中GDM组血浆中LDL、APOB的浓度水平与正常组比较明显升高(P<0.05)， HDL、APOA浓度水平与正常组比较明显降低(P<0.05)，且GDM组血浆中TNF-α、VCAM-1分别与LDL、APOB浓度呈正相关(P<0.05)，与HDL、APOA浓度呈负相关(P<0.05)，而正常组血浆中TNF-α、VCAM-1分别与HDL、LDL、APOA和APOB没有相关性(P>0.05)。

综上所述，通过监测妊娠期糖尿病患者血浆和胎盘组织中TNF-α、VCAM-1的表达，结合FBG、HbA1c、HDL、LDL、APOA及APOB的水平，评估妊娠期糖尿病病情的严重程度和胎儿宫内环境，为胎儿胎盘血管内皮功能障碍提供治疗方案，改善不良妊娠结局及降低孕产妇和围生儿代谢疾病发生的风险。