HPLC法测定去炎酊中游离大黄素和大黄酚的含量

曲靖市中医医院，云南 曲靖 655000

去炎酊是由重楼、大黄、红花、白芷、虎杖、紫草、草乌、独定子、马钱子、生南星、苦参等中药经渗漉制成的酊剂。有清热除湿、泻火解毒、活血化瘀、消肿止痛、消炎排脓之功效，主治跌打损伤、外伤感染、痈疽、疮疖、蚊虫叮咬、皮肤痒疹等。大黄为方中君药，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄，用于实热积滞便秘、血热吐衄、目赤咽肿、痈肿疔疮、肠痈腹痛、瘀血经闭、产后瘀阻、跌打损伤、湿热痢疾、黄疸尿赤、淋证，水肿，外治烧烫伤；虎杖具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰，用于实热黄疸、淋浊、带下、风湿痹痛、痈肿疮毒、水火烫伤、经闭、癥瘕、跌打损伤、肺热咳嗽[1]。现代药理研究表明，大黄有泻下、兴奋胃肠平滑肌、对消化道黏膜保护、抗病原微生物及抗炎、保护心脑血管、抗肿瘤、保肝利胆等[2]作用；虎杖有抗炎、抗病毒、抗菌、调血脂、抗血栓、改变血流变、扩张血管、保护心肌、抗氧化、抗肿瘤、改善阿尔茨海默病症状及预防艾滋病等[3]作用。去炎酊现行质量标准简单，没有对处方中任何一味中药进行含量测定。本文参照中国药典[1]及文献[4-12]，建立了HPLC法测定去炎酊中游离大黄素和大黄酚含量的方法,为去炎酊的质量标准提升提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-20AT型高效液相色谱仪(配有四元泵，自动进样器，紫外检测器，柱温箱，真空在线脱气机，LC solution工作站)(株式会社岛津制作所)，AE240型电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 材料 去炎酊(曲靖市中医医院，批号: ZD2017040，ZD2017041，ZD2017042，ZD2017043，规格：60 mL/瓶)；大黄素对照品(批号:110756-201512，含量：98.7%)、大黄酚对照品(批号:110796-201520，含量：99.2%)，以上对照品均购置于中国食品药品检定研究院；乙腈(德国默克公司)为色谱纯；水为双蒸水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取大黄素和大黄酚对照品适量，用乙醇制成每1 mL分别含大黄素和大黄酚423.020和176.183 μg/mL的对照品溶液储备液，精密量取对照品储备液1 mL，置10 mL容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得对照品使用液。

2.1.2 供试品溶液 精密量取已摇匀的去炎酊10 mL，置25 mL容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

2.1.3 阴性样品溶液 按处方比例及制法，制得不含大黄和虎杖的阴性样品。按“2.1.2”项下方法制成阴性样品溶液。

2.2 色谱条件 色谱柱：依利特C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温为30 ℃；流动相：0.1%磷酸溶液-甲醇 (25∶75)；流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm；进样量：10 μL。

2.3 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.1”项下的对照品储备液0.2、0.5、1.0、2.5、5.0 mL分别置10 mL容量瓶中, 加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得标准系列。分别取10 μL进样，记录峰面积。以质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，分别得大黄素和大黄酚回归方程为Y=36 418X-58 243，r=1.000 0(n=5)和Y=59 776X-39 442，r=1.000 0(n=5)。结果表明，大黄素和大黄酚的质量浓度在分别在8.460 4～211.510 0和3.523 7～88.091 5 μg/mL的范围内与对应峰面积呈良好的线性关系。混合对照品、供试品及阴性样品的色谱图如图1所示。

2.4 专属性试验 吸取“2.1”项下的3种溶液，在“2.2”项下的色谱条件测定，结果样品在与对照品保留时间相应位置上，有相应的色谱峰，阴性样品在与对照品保留时间相应位置上，没有相应的色谱峰，表明阴性样品不干扰测定。

2.5 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下的对照品使用液，在“2.2”项下的色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。结果，大黄素和大黄酚的RSD分别为0.23%和0.22%,表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批样品(批号：ZD2017040)6份，每份10 mL，按“2.1.2”项下制备，在“2.2”项下的色谱条件测定大黄素和大黄酚的含量，其含量的RSD分别为0.45%和0.51%。

2.7 稳定性试验 取“2.1.2”项下制备的同一样品，室温下放置，分别以0，2，4，8，16，24，36 h时，在“2.2”项下的色谱条件测定，记录峰面积。结果，大黄素和大黄酚的RSD分别为0.55%和0.60%,表明样品36 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 精密量取已测定含量的去炎酊 (批号：ZD2017040)6份，每份5 mL，置25 mL容量瓶中，精密加入对照品储备液1.3 mL，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。在“2.2”项下的色谱条件测定，测得大黄素和大黄酚的加样回收率见表1。

2.9 样品测定结果 取4批去炎酊，按“2.1.2”项下的方法制备，在“2.2”项下色谱条件测定含量。结果见表2。

表1 加样回收率试验结果 (n=6)

表2样品含量测定结果 (mg/mL，n=2)

批号大黄素大黄酚ZD20170400.120 40.041 5ZD20170410.119 80.041 1ZD20170420.119 70.041 1ZD20170430.120 00.041 5

3 讨论

3.1 检测指标的选择 大黄和虎杖的主要成分是芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，中国药典[1]也是选择上述5成分作为定量指标，但从样品测定结果看芦荟大黄素、大黄酸、大黄素甲醚含量相对较低，用作定量指标误差偏大，所以参考文献[4-8,12]，选择大黄素和大黄酚为大黄及虎杖的质量控制指标。

3.2 样品提取溶剂及方法的选择 由于样品是酊剂，是60%的乙醇溶液，根据大黄素和大黄酚在乙醇中溶解度相对高些，并结合样品的制法，选择用60%乙醇作为提取溶剂，因为此样品为溶液，所以不需要长时间提取，实际上只要摇匀即可，经试验，振摇5 min的提取方法，就能满足回收率要求，而且简单易行。

3.3 检测波长的选择 分别取大黄素、大黄酚对照品的60%乙醇溶液在200～550 nm范围内进行紫外扫描，大黄素在221、254、289 nm处有最大吸收，大黄酚在225、257 nm处有最大吸收。用221 nm或225 nm的波长时，杂质干扰峰偏多，用289 nm的波长时，大黄酚的响应值偏低，参照中国药典[1]及文献[4-8,10-12]，并综合其他波长处杂质干扰峰的情况，将检测波长定为254 nm比较合适。

3.4 流动相的选择 试验过甲醇-水系统和乙腈-水系统，但色谱峰有些拖尾，参照中国药典[1]及文献[4-11]，将水换成0.1%磷酸溶液，峰形变好，最后确定为0.1%磷酸溶液-甲醇系统，经过对流动相比例进行反复调整，发现当流动相为0.1%磷酸溶液-甲醇(25∶75)时，分离良好，且分析时间适宜，最终确定为0.1%磷酸溶液-甲醇(25∶75)为本实验流动相。

3.5 方法适用 大黄素和大黄酚有游离型与结合型两种形态，因为本方法没有进行加酸水解，只能测定游离型的大黄素和大黄酚，要测定总的大黄素和大黄酚需要加酸水解将结合型的大黄素和大黄酚游离出来才能测定，所以需要加酸水解-加热回流-液液萃取3个环节才能完成，操作繁琐，测定游离型的大黄素和大黄酚也能有效控制本制剂中大黄和虎杖的质量。

4 结论

去炎酊现行质量标准修检验项目缺少定量检测方法。本文根据去炎酊组方工艺特点，参考相关文献，选择大黄素、大黄酚作为质量控制指标，用C18色谱柱，在254 nm波长处进行检测，柱温30 ℃，用0.1%磷酸溶液-甲醇(25∶75)为流动相，控制流速为1.0 mL/min，结果大黄素和大黄酚在各自浓度范围内均呈现良好的线性关系，精密度、重复性、稳定性、平均加样回收试验结果符合要求。该方法专属性强、简单易行、节约时间和成本，可用于测定去炎酊中游离大黄素和大黄酚的含量。