Box-Behnken效应面法优化牛大力总黄酮提取工艺

谭志灿 丘思兰2,3* 高 妮

1.广州市医药职业学校，广东 广州 510430；2.广州医科大学附属第五医院，广东 广州 510700；3.广州医科大学第五临床学院，广东 广州 510700

牛大力，别名大力牛、甜牛大力、大力薯、扒山虎、血藤、金钟根、倒吊金锤等，原植物为攀缘灌木，为豆科植物美丽崖豆藤MillettiaspeciosaChamp.的干燥根[1]。全年均可采挖，以夏、秋季为佳，整理洗净，除去芦头和须根，切厚片或切段，晒干即可。主产于广东、广西、海南、福建、湖南、云南、贵州等地,生于灌木林丛、路边或疏林中。牛大力味甘、性平，归肺、脾、肾经，能补虚润肺、强筋活络，用于病后虚弱、阴虚咳嗽等症。现代研究表明，牛大力主要含有生物碱类化合物、黄酮类化合物、三萜类化合物、多糖类化合物和植物甾醇等多种成分[2-4]，具有镇咳、祛痰、平喘、保肝、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、提高免疫功能等作用[5-8]。本实验的研究对象为具有抗氧化活性的总黄酮[7]，采用Box-Behnken效应面法优选牛大力总黄酮提取工艺，为牛大力的综合利用提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 SP-756PC型紫外-可见分光光度计(上海光谱仪器)；CJ-100ST功率可调加温定时型超声波清洗机(深圳市超洁科技)；AL104型电子分析天平(上海梅特勒托利多仪器)。

1.2 材料 牛大力(批号1803001，广州市岭南中药饮片有限公司)经鉴定为豆科植物美丽崖豆藤MillettiaspeciosaChamp.的干燥根；芦丁对照品(批号100086-201755，中国食品药品检定研究院)。

2 方法与结果

2.1 含量测定[9-10]

2.1.1 对照品溶液 取芦丁对照品适量，精密称定，置25 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得每1 mL含芦丁0.468 mg的对照品溶液。

2.1.2 标准曲线 精密量取“2.1.1”项下对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置25 mL量瓶中，加乙醇至6 mL，依次加入5%亚硝酸钠溶液1 mL、10%硝酸铝溶液1 mL，每次加入后均摇匀并放置6 min，再加入4%氢氧化钠溶液10 mL，加水至刻度，摇匀后放置15 min，以随行试剂为空白，于505 nm处测定吸光度，得方程A=15.1364C-0.0163，r=0.9993，线性范围0.009 36～0.056 16 mg/mL，式中A为吸光度、C为浓度。

2.1.3 供试品溶液 取牛大力药材粉末约1 g，精密称定，按照“2.2”项下的实验方法制备供试品溶液。

2.1.4 样品测定 精密量取“2.1.3”项下供试品溶液5 mL，照“2.1.2”项下的方法，测定吸光度，计算总黄酮含量。

2.2 Box-Behnken效应面法实验设计[11]根据前期的单因素试验结果，采用超声提取法，功率500 W，温度60 ℃，提取2次，选取乙醇浓度A、乙醇体积B、提取时间C为考察因素，以牛大力总黄酮的提取率为响应值，Box-Behnken效应面法的实验设计及结果见表1。

表1 Box-Behnken实验设计及结果

采用Design Expert 7.0.0软件对表1实验数据进行多元线性回归拟合，得二次多项回归模型方程：Y=-16.052 19+0.198 12A+0.554 58B+0.197 63C+1.500 00×10-3AB-1.500 00×10-4AC+8.333 33×10-5BC-1.387 50×10-3A2-0.015 139B2-1.612 50×10-3C2。结果显示，相关系数R2为0.987 6，变异系数C.V.为1.29%，模型拟合良好。由表2可知，3个考察因素A、B、C的一次项和二次项均达极显著水平(P<0.01)，失拟项不显著(P>0.05)。为了直观反映分析结果，采用Design Expert软件作出相应的等高线图和效应面图，如图1、2所示。

表2 方程的显著性检验及方差分析

注：*P<0.05显著性差异；**P<0.01极显著性差异。

2.3 验证试验 根据“2.2”项下的回归方程确定最优工艺：乙醇浓度81.07%，乙醇体积21.63倍，超声提取2次、每次52.51 min，温度60 ℃。在此条件下，牛大力总黄酮理论提取率为3.821 1 mg/g。对最佳提取工艺进行3次验证试验，结果总黄酮平均提取率3.81 mg/g (RSD=0.961%)。验证试验表明，所优选的提取工艺稳定可行、重复性良好。

3 讨论

实验采用Box-Behnken效应面法进行实验设计，优选牛大力总黄酮的提取工艺。Box-Behnken效应面法具有实验次数少，结果预测精度高的特点，很好地解决了多变量问题。在实验设计中，Center Points per Block设定为5，即中心点选择5次重复，用以估计实验误差。

根据前期的单因素试验结果，本次实验选择超声提取法，固定超声功率为500 W、超声温度为60 ℃、提取次数为2次，选取对实验结果影响较大的3个因素(乙醇浓度、乙醇体积和提取时间)进行考察，以减少Box-Behnken效应面法的试验次数。由结果可知，每个因素的交互作用较小，其1次项和2次项对牛大力总黄酮提取率贡献较大。回归模型通过显著性检验及方差分析，具有统计学意义(P<0.01)，回归模型可信度好。利用回归模型算出最佳工艺参数，通过验证试验，相对标准偏差RSD值为0.961%，理论值和实验值之间高度吻合，为牛大力的综合利用提供实验依据。