响应面法优化牛蒡根总黄酮超声波提取工艺

刘群群，王 燕，邱艳明，毛群芳

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙 410128；2.湖南中医药高等专科学校，湖南株洲 412000）

牛蒡（Arctium lappa L.），又名恶实、大力子、东洋参，又名东洋牛鞭菜等，主要分布于中国、西欧、克什米尔地区、欧洲等地。我国牛蒡的种植地主要分布于江苏省和山东省，尤以江苏省的徐州丰县、沛县，山东省的苍山种植历史悠久、面积规模较大[1]。牛蒡根中含有许多药用成分，如小分子的挥发油、多酚类、黄酮类化合物[2]、醛类，以及多炔类物质，如绿原酸、牛蒡甙、木脂素等[3-4]，其具有多种药物作用及保健功效，特别是对心脑血管保护、抗氧化、抗衰老、抗菌及抗病毒、保护肝肾胃肠损伤、抗疲劳、抗肿瘤、抗突变、调节糖代谢和脂代谢紊乱、免疫调节、抗炎、调整肠道菌群、润肠通便和预防男性疾病等方面都具有一定的作用[5]。已有相关研究表明，黄酮类化合物具有降血脂、降血压、抑制血小板聚集、镇痛等多种药理作用及保健功效，是一种特别有开发意义的保健品原材料[6]。

超声波产生的机械振动和强烈的空化效应会破坏细胞的结构，能够加速目标成分的溶出。超声波辅助提取不仅能缩短提取时间，还避免了高温对有效成分的破坏[7]。试验在超声波辅助前提下研究了提取牛蒡根总黄酮的影响因素，优化了牛蒡根总黄酮的提取工艺条件，为牛蒡根黄酮的开发和利用提供了研究的基础。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

牛蒡根，徐州大自然公司提供；芦丁对照品，中国药品生物制品检定所提供；NaNO2、无水乙醇、Al（NO3）3、NaOH等试剂，均为分析纯。

QE-5A型高速中药粉粹机，武义县屹立工具有限公司产品；CPA225D型电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品；101A-4型电热鼓风恒温干燥箱，上海康路仪器设备有限公司产品；KQ-100B型超声波清洗器，巩义市予华仪器有限责任公司产品；L5S型紫外可见分光光度计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 牛蒡根的预处理

将新鲜的牛蒡根清洗干净、切片，并用0.75%维C溶液浸泡30 min，沥干水分后于40℃条件下鼓风干燥至恒质量，粉粹过60筛，得牛蒡根干粉，低温冷冻储存以备用。

1.2.2 黄酮含量的测定

黄酮含量的测定采用 NaNO2-Al（NO3）3法[8]。以芦丁为标准品，制作标准曲线，得到吸光度与黄酮质量浓度的方程：

Y=0.012 1X+0.029 8，R2=0.999 0.将0.5 mL牛蒡根总黄酮提取液加入到25 mL比色管中，再加5%的NaNO2溶液0.4 mL，摇匀，静置6 min后加入10%Al（NO3）3溶液0.4 mL，摇匀后静置6 min，最后加入4%NaOH溶液4.0 mL，用纯水定容至25 mL刻度，在室温下静置15 min后，于波长509 nm处测定处吸光度，并将其代入标准曲线，求得比色管中牛蒡根总黄酮的质量浓度，计算牛蒡根总黄酮的提取率。

式中：C——牛蒡根总黄酮的质量浓度，μg/mL；

V1——25 mL（比色管量程）；

V2——0.5 mL（反应体系中牛蒡根总黄酮提取液的体积）；

V——牛蒡根总黄酮提取液的总体积，mL；

m——牛蒡粉质量，g。

1.2.3 总黄酮提取单因素试验

（1）料液比对牛蒡根中总黄酮提取率的影响。选取料液比 1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g∶mL），在超声功率100 W，乙醇体积分数60%，提取时间30 min，提取温度40℃条件下，研究料液比对牛蒡根总黄酮提取率的影响。

（2）乙醇体积分数对牛蒡根总黄酮提取率的影响。分别选用体积分数为20%，40%，60%，80%，100%的乙醇溶液作为溶剂，在超声功率100 W，提取时间30 min、料液比1∶20（g∶mL），提取温度40℃条件下，研究乙醇体积分数对牛蒡根总黄酮提取率的影响。

（3）提取时间对牛蒡根总黄酮提取率的影响。选择提取时间分别为20，30，40，50，60，70 min，在超声功率100 W，提取温度40℃，乙醇体积分数60%，料液比1∶20（g∶mL）条件下，研究提取时间对牛蒡根总黄酮提取率的影响。

（4）提取温度对牛蒡根总黄酮得率的影响。选取提取温度30，40，50，60，70，80℃，在超声功率100 W、乙醇体积分数60%，料液比1∶20（g∶mL），提取时间30 min条件下，研究不同提取温度对牛蒡根总黄酮提取率的影响。

1.2.4 响应面设计

在单因素试验的基础上，以料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度为考查因素，牛蒡根总黄酮的提取率为响应值进行Box-Behnken的中心组合设计（四因素三水平）。通过Design Expert 10.0.3软件进行数据分析和试验设计，优化牛蒡根总黄酮在超声波辅助下的提取条件。

Box-Behnken的中心组合因素水平见表1。

表1 Box-Behnken的中心组合因素水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 料液比对牛蒡根总黄酮提取率的影响

料液比对牛蒡根总黄酮提取率的影响见图1。

图1 料液比对牛蒡根总黄酮提取率的影响

由图1可知，料液比为1∶10～1∶20（g∶mL）时，黄酮提取率随料液比的增加而增加；料液比为1∶20时，总黄酮提取率达到最大；料液比超过1∶20时，提取率反而下降。这是由于随着溶剂与原料的比值增大浓度差也就增大，这虽然促进了传质的过程，但是当比例过大时，影响了超声波产生的效应，使得黄酮提取率不增加反而下降[9]。因而，最适料液比选择为1∶20（g∶mL）。

2.1.2 乙醇体积分数对牛蒡根总黄酮提取率的影响

乙醇体积分数对牛蒡根总黄酮提取率的影响见图2。

由图2可知，牛蒡根总黄酮提取率随乙醇体积分数的增加先增加后急速降低，当乙醇体积分数为80%时，其提取率最高，此结果与蔡茜彤等人的研究结果一致；现有研究表明[10]，植物中的黄酮类化合物主要以苷元和苷类的形式存在，高体积分数的乙醇更适于黄酮苷元的提取，而低体积分数的乙醇（60%以下）适于黄酮苷的提取。这也说明牛蒡根中黄酮苷元比黄酮苷类含量更高，因此最佳的乙醇体积分数选为80%。

2.1.3 提取时间对牛蒡根总黄酮提取率的影响

提取时间对牛蒡根总黄酮提取率的影响见图3。

图2 乙醇体积分数对牛蒡根总黄酮提取率的影响

图3 提取时间对牛蒡根总黄酮提取率的影响

由图3可知，在60 min以内，牛蒡根总黄酮提取率随着提取时间的延长而增大；而60 min以后，其随时间的增加而减少，由此确定最佳提取时间为60 min。由于细胞的破裂和黄酮类物质的溶出都需要时间，黄酮类物质随着提取时间的增加提取也越充分，但是时间过长，超声波巨大的机械能会破坏黄酮类物质，而使黄酮类物质提取率下降[11]。

2.1.4 提取温度对牛蒡根总黄酮提取率的影响

提取温度对牛蒡根总黄酮得率的影响见图4。

图4 提取温度对牛蒡根总黄酮得率的影响

由图4可知，提取温度在30～60℃时，黄酮提取率迅速增加；但当提取温度大于60℃时，黄酮提取率随温度的增加反而降低，呈现先增加后减小的趋势。这主要是因为升高的提取温度，增大了扩散系数，降低了提取液黏度，加快了分子热运动的速度，从而促进了物质的溶出。但温度过高，会破坏牛蒡根总黄酮的组织结构，使其被氧化分解，同时，溶剂会随温度的升高而损失，杂质溶出也会大量增加，而使总黄酮的提取率降低[12]。由此，牛蒡根总黄酮最适提取温度为60℃。

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 响应面结果

根据Box-Beknhen中心组合试验设计，以料液比、乙醇体积分数、提取温度、提取时间为考查因素，在单因素基础上进行了四因素三水平的响应面试验设计。

响应面试验设计见表2。

利用Design Expert 10.0.3软件对表2中的试验数据进行了多元回归拟合，并对影响牛蒡根总黄酮提取的因素进行条件优化，得到牛蒡根总黄酮提取的回归方程：

2.2.2 响应面分析

对响应面试验结果进行方差分析。

方差分析见表3。

表3 方差分析

图5 料液比和乙醇体积分数交互影响

图6 料液比和提取温度的交互影响

图7 提取时间和料液比的交互影响

图8 乙醇体积分数和提取时间的交互影响

图9 提取时间和提取温度的交互影响

图10 乙醇体积分数和提取温度的交互影响

由表3可知，该回归模型的p＜0.001，为极显著水平，相关系数R2=0.928 5，说明自变量和响应值之间、预测值与试验值之间有显著的关系，试验模型与实际试验能较好的拟合。而且失拟项p=0.534 8>0.05，差异不显著，试验误差小，这说明该模型能较好的拟合牛蒡根总黄酮提取率的实际值与预测值。变异系数（CV%）为2.34%，较小，说明试验结果重复性较好。从检验值F可以看出，影响牛蒡根中总黄酮提取率的因素的主次顺序为料液比（A）>乙醇体积分数（B）>提取温度（C）>提取时间（D），其中乙醇体积分数、乙醇体积分数的二次项、料液比、料液比的二次项、提取温度的二次项都是极显著水平，而其他的则不显著。

料液比和乙醇体积分数的交互影响见图5，料液比和提取温度的交互影响见图6，提取时间和料液比的交互影响见图7，乙醇体积分数和提取时间的交互影响见图8，提取温度和提取时间的交互影响见图9，乙醇体积分数和提取温度的交互影响见图10。

由图5～图10可知，响应面图呈现凸状，开口朝下，并且有最高点，且从最高点向四周边缘逐渐下降，这表明各因素作用增大时，响应面值也增大，达到最高点后，各因素作用增大，响应面值反而减小[13]。

2.2.3 验证试验

经过Design Expert 10.0.3软件进行分析，牛蒡根总黄酮在超声波功率为100 W辅助提取下的最优提取条件为料液1∶23.48（g∶mL），提取温度60.05℃，乙醇体积分数61.05%，提取时间59.03 min，从该条件得出的牛蒡根总黄酮提取率为28.19 mg/g。为了方便实际操作，将各因素稍作调整，分别取整数为料液比1∶23（g∶mL），提取温度60℃，乙醇体积分数61%，提取时间59 min，该条件下测得的牛蒡根总黄酮提取率为27.96 mg/g，和理论值比较，相对误差为0.82%，试验值与理论值能够吻合较好。说明该模型对牛蒡根总黄酮提取条件拟合较好，得到的优化条件可行。

3 结论

以牛蒡根为原料，在单因素试验的基础上，通过响应面法优化提取条件，得出超声功率为100 W时的牛蒡根中总黄酮的最佳提取条件为料液比1∶23（g∶mL），乙醇体积分数61%，提取温度 60℃，提取时间59 min，在此条件下，得到牛蒡根总黄酮提取率为27.96 mg/g。研究结果表明，牛蒡根中总黄酮含量丰富，是黄酮提取的良好原材料，具有较好的开发潜能，为进一步研究牛蒡黄酮提供了理论基础。