谷物中玉米赤霉烯酮残留的胶体金免疫层析法测定

何方洋 ，万宇平 ，崔廷婷 ，张慧，王琳琛 ，王兆芹

1. 北京勤邦生物技术有限公司（北京 102206）；2. 河南双汇投资发展股份有限公司（漯河 462003）；3. 北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心（北京 102206）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN），又名F-2毒素，是一种由多种镰刀菌产生的具有雌激素作用的非甾体霉菌毒素[1]，多见于霉变的农作物中，是世界范围内粮食饲料的污染物之一，在动物源性食品中也常被检出，污染率较高[2]。研究表明，ZEN具有细胞毒性、免疫毒性、肝肾毒性、生殖毒性、遗传毒性及可疑致癌性，可通过食物链进入人体，严重危害人类健康[3-4]。我国GB 2761—2017中规定谷物及其制品中ZEN的限量为60 μg/kg[5]。

目前比较常用的检测ZEN的方法有薄层色谱法（TLC）[6]、高效液相色谱法（HPLC）[7-9]、液相色谱-质谱法（LC-MS）[10-11]及酶联免疫吸附法（ELISA）[12-13]等，但由于样品前处理过程繁琐，对仪器设备、人员技术依赖性较高，不能实现对大批量样品的现场快速筛选。胶体金免疫层析技术（GICA）是一种将胶体金免疫技术和色谱层析技术相结合的固相膜免疫分析方法，具有操作简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，被广泛应用于食品中有害物质残留检测中。因此试验基于胶体金免疫层析技术，拟开发一种快速检测谷物中玉米赤霉烯酮的胶体金试纸条，为真菌毒素的快速检测提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米赤霉烯酮及各种交叉反应真菌毒素标准品，北京标准物质研究中心；玉米赤霉烯酮单克隆抗体，北京勤邦生物技术有限公司自制；氯金酸（HAuCl4·4H2O）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、羊抗鼠IgG，美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯试剂；硝酸纤维素膜（NC膜）、样品垫、吸水垫、PVC底板，上海金标生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

2000 SBL电子天平，美国Setra公司；JEM-1230透射电子显微镜，日本电子株式会社；90-2磁力搅拌器，上海振荣科学仪器有限公司；LGJ-50 C冻干机，北京四环科学仪器厂有限公司；XYZ 3000点膜仪，Bio-Dot公司；CT 300数控切条机，上海金标生物科技有限公司；TDL-40 B低速大容量离心机、TGL-20 bR高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；液相色谱仪，配有荧光检测器，Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米赤霉烯酮半抗原的合成

合成路线见图1。取100 mg对氨基苯丙酸，加40 μ L 1 mol/L稀盐酸，加1 mL蒸馏水稀释溶解，冷却到0℃搅拌，加47 mg亚硝酸钠，搅拌2 h，得到苯丙氨酸的重氮盐溶液；取120 mg玉米赤霉烯酮加乙醇溶解，加20 mg碳酸钾，于0 ℃搅拌，加入上述重氮盐溶液，搅拌2 h；停止反应，加水，乙酸乙酯萃取，蒸干，上硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯（1︰1，V/V）洗脱分离，得到半抗原产物。其化学结构用核磁共振鉴定。

图1 玉米赤霉烯酮半抗原的合成路线

1.3.2 人工抗原的制备

采用混合酸酐法[14]，将玉米赤霉烯酮半抗原与卵清蛋白偶联，作为包被原。

1.3.3 胶体金的制备及质量分析

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金[15]。制备好的胶体金通过肉眼观察溶液是否浑浊，有无漂浮物及颗粒沉淀物；并使用透射电镜观察胶体金颗粒大小是否均匀一致，有无发生颗粒聚集现象。

1.3.4 单克隆抗体-胶体金标记物的制备

取100 mL胶体金溶液至锥形瓶中，在磁力搅拌下，用0.2 mol/L K2CO3调节pH至7.2，室温下加入24 μg ZEN单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置10 min；加入质量分数为10%的BSA至终质量分数为1%，静置10 min。于4 ℃、以12 000 r/min离心40 min，弃上清液，如此洗涤2～4次，将沉淀用含2% BSA（质量分数）的PBS缓冲液（pH 7.4，0.01 mol/L）溶解，用0.22 μm无菌过滤器过滤后，于4 ℃保存备用。

向微孔条中加入50 μL ZEN单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度-50 ℃条件下，预冻3 h后，再真空20 ℃干燥15 h，取出，即得到冻干有ZEN单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。

1.3.5 胶体金免疫层析试纸条的组装

将样品垫置于含0.5% BSA（质量分数）的PBS缓冲液（pH 7.2，0.1 mol/L）中浸泡2 h，于37 ℃烘干2 h备用。包被原ZEN-OVA用PBS缓冲液（pH 7.4，0.01 mol/L）稀释至1 mg/mL，用喷膜仪喷于NC膜上，喷量为1 μL/cm，为检测线；在检测线上5 mm处喷涂羊抗鼠IgG（0.5 mg/mL），喷量为1 μL/cm，为质控线，于37 ℃干燥2 h。将样品垫、样品垫贴纸膜、NC膜、吸水垫及PVC底板组装好后，切成4 mm宽，与冻干有ZEN单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂配合使用。

1.3.6 样品检测

小麦、大米、黄豆、玉米为市售，经免疫亲和柱净化-液相色谱法[16]验证为空白的样品，具体前处理方法如下：称取5.0±0.05 g粉碎的样品至50 mL聚苯乙烯离心管中，加入15 mL 80%的甲醇，将瓶塞盖紧，用涡旋仪涡动5 min，于3 000 r/min以上离心5 min；取100 μ L上清液，加入300 μ L样品稀释液中混匀，待检。

1.3.7 检测方法

用微量移液器吸取200 μL待检样品溶液于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中的ZEN单克隆抗体-胶体金标记物混匀，于20～25 ℃孵育5 min后，将试纸条插入微孔中，使之充分浸入溶液中；再次于20～25 ℃孵育5 min后，取出试纸条，判定结果。如果检测线和质控线上均出现红色条带，说明样品呈阴性（-）；如果质控线上出现红色条带，检测线上没出现红色条带，说明样品呈阳性（+）。

1.3.8 试纸条的性能评价1.3.8.1 检测限

采用1.3.6所述的样品前处理方法时，在空白样品中分别添加ZEN标准品至质量浓度为10，20，50，80，100，200，500，800和1 000 μg/L，另设阴性对照，用试纸条进行检测，每个浓度样品重复3次，判断试纸条的检测限。

1.3.8.2 灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率

随机取空白小麦、大米、黄豆、玉米样品，共50份，分别添加ZEN标准品质量浓度为1.3.8.1所确定的检测限的0.5，1和2倍水平，共计样品200份，用试纸条进行检测，根据《食品快速检测方法评价技术规范》[17]计算灵敏度等性能指标。

1.3.8.3 有效性验证

取不同产地的小麦、大米、黄豆、玉米样品各5份，采用1.3.6所述的方法经前处理后，用试纸条进行检测，每个样品重复3次。同时按GB/T 5009.209—2016[16]中的液相色谱法（对粮食和粮食制品中玉米赤霉烯酮的检出限为5 μg/kg），用仪器方法进行对比。

2 结果与分析

2.1 半抗原的核磁共振氢谱鉴定

取半抗原产物经核磁共振得1H-NMR（CDCl3，300 MHz）δ：11.0（s，1H，COOH），8.53（d，2H，ArH），7.53，7.49（d，2H，ArH），6.76（s，1H，ArH），5.89（s，2H，—HC==CH—），5.35（s，2H，ArOH），4.13（m，1H，—O—CH—），2.79（t，2H，—CH2—），2.51（t，2H，—CH2—），2.44-2.47（m，4H，—CH2—C==O—CH2—），1.96（t，4H，—CH2—），1.37（s，3H，—CH3）。图谱中化学位移δ=11为羧基氢，δ=2.51，2.79为苯丙氨酸支链氢，δ=8.53，7.49为苯丙氨酸苯环上的氢，这些化学位移氢的存在说明重氮偶合反应成功，证明玉米赤霉烯酮半抗原结构正确。

2.2 胶体金质量鉴定

通过肉眼观察，制备好的胶体金为清亮透明的酒红色溶液，未发现漂浮物及颗粒沉淀物。图2为胶体金的透射电镜100 000×扫描图，可以看出胶体金颗粒大小均匀，间距比较松散，未出现聚集现象。随机选取100个颗粒并测定直径，初步确定平均直径约为20 nm。

2.3 检测限

对质量浓度0 μg/L的空白样品检测时，检测线均出现较深的红色条带；随着ZEN标准品质量浓度的增加，检测线条带逐渐减弱，当质量浓度增加至100 μ g/L时，检测线无红色条带；继续增加至1 000 μ g/L时，检测线都无红色条带出现；质控线均出现较深的红色条带（见表1）。以只出现质控线时的最低标准品质量浓度作为试纸条的检测限，即为100 μg/L。

表1 玉米赤霉烯酮残留检测试纸条的检测限

2.4 灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率

根据《食品快速检测方法评价技术规范》，该方法灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率各性能指标的计算方法及结果见表2。

表2 玉米赤霉烯酮残留检测试纸条性能指标计算方法及结果

2.5 有效性验证

20份样品经试纸条检测后，有1份小麦、2份黄豆和1份玉米结果显示阳性，其他样品检测结果均为阴性。用仪器方法检测20份样品，检测结果显示也仅有上述4份样品中ZEN高于阳性判定线（100 μg/kg），表明两种方法结果一致，结果见表3。

表3 GICA与仪器方法检测样品中玉米赤霉烯酮结果的比较

3 结论

试验基于竞争抑制免疫层析原理，建立了一种快速、简便、针对谷物中玉米赤霉烯酮残留的检测方法，方法的检测限为100 μg/kg，灵敏度为99%，特异性为94%，假阴性率为1%，假阳性率为6%，从样品前处理到检测，整个分析流程耗时20 min。与其他方法相比，该方法具有快速、简便、灵敏度高和经济适用等特点，在样品提取步骤中不需要复杂的净化过程，大大提高了检测效率，十分适合现场大批量样品的快速检测。而且采用了将胶体金标记的单克隆抗体直接冻干在微孔试剂中，这样在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度，易于对样品中的毒素残留情况进行分析。但由于胶体金免疫层析法主要通过目测颜色来判断结果，比较主观，可能出现假阳性问题，因此对于阳性样品，还需要用液相色谱法等仪器方法进行确证。尽管如此，但此方法作为一种快速筛查手段，可以有效地弥补因设备和经费问题而无法开展谷物中玉米赤霉烯酮检测和监控的问题，具有重要的经济价值和社会价值。