银杏葡萄酒自由基清除能力及其与总酚含量的关系

冯涛，赵宇，桑敏，王旭增，张钰*

1. 上海应用技术大学香料香精技术与工程学院（上海 201418）；2. 上海应用技术大学技术转移中心（上海 200235）

银杏（Gingko，Gingko biloba L.）主要种植于在温带、亚热带地区，是世界上最古老的树种之一，并且在我国资源丰富，占世界总资源的70%以上[1]。近年来，关于银杏叶提取物的药用价值和保健价值得到各行各业的广泛关注。然而，目前对于银杏种仁的研究较少，银杏果的深加工还处在初始阶段，造成银杏果经济效益不乐观。作为一种传统食品和药品的来源，银杏种仁早在五千年前就被用于添加到甜点、饮料和酒当中，并且作为中国传统药材也被记录在《本草纲目》当中[2]。银杏果实中富含淀粉、维生素、蛋白质以及多种氨基酸；成熟的果实中还含有多种N、K等常量元素以及Zn、Fe等微量元素[3]。除此之外，果实中含有丰富的黄酮类、酚类及内酯类等生物活性成分，能够降血脂、促进血液循环、止咳平喘及清除自由基，具有极高的药用价值及保健价值[4-5]。

目前银杏在酿酒行业的应用主要体现在银杏叶提取物参与酒精发酵以及银杏果酿造白酒上[6-7]，对于银杏果应用于葡萄酒行业的还未见报道。因此以葡萄酒为依托，开发一种新型葡萄酒，既可以丰富葡萄酒的种类，又可以延长银杏产业链的发展，提高其经济附加值。

氧自由基与衰老、癌症、心脑血管疾病和炎症的发生与发展密切相关，因此清除自由基的能力是评价抗氧化能力大小的一个重要指标[8-9]。流行病学研究表明，适量饮用葡萄酒对于人体健康具有很大的益处[10-11]，还可以增加血清抗氧化能力，这是由于葡萄酒中含有丰富的酚类化合物，具有预防冠心病、减少癌症发病率和慢性疾病的作用[12-13]。此外，有研究表明，银杏果中含有丰富的银杏多糖、银杏蛋白以及黄酮类、酚类、萜类、内酯类化合物，具有清除自由基活性以及预防心血管疾病的能力[14]。流行病学研究建议适当食用某些具有抗氧化生物活性的植物材料（比如银杏、葡萄等）可减少氧化应激相关慢性疾病的发生风险，从而加强身体健康[15-16]。

为此，试验以葡萄酒为依托酿造银杏葡萄酒，开发出一种新型保健酒。新产品不但具有较好的营养保健作用，而且风味口感协调，为银杏葡萄酒的工业化生产提供理论与试验依据，并对其总酚含量以及抗氧化活性进行测定，同时研究总酚含量与抗氧化活性之间的相关性，为消费者选择有益于身体健康的葡萄酒提供有力参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄（Vitis L.），上海市奉贤区海湾镇葡萄种植园；银杏（Gingko biloba L.），市售；酿酒酵母，安琪酵母有限公司。

福林-肖卡（Folin-Ciocalteau，FC）试剂；DPPH（1, 1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl）、ABTS [2, 2’-Azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）]、Trolox，美国Sigma-Aldrich公司；没食子酸、槲皮素、阿魏酸、咖啡酸、香豆酸、儿茶素、表儿茶素（均为色谱纯）、乙腈（色谱纯）、没食子酸、碳酸钠、过硫酸钾、无水乙醇，均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-2350紫外分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；QL-901漩涡混合仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；1260 Indinity高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 银杏葡萄酒酿造工艺流程

1.3.2 主要理化指标的测定

酒精度、总糖、总酸、挥发酸、游离二氧化硫含量的测定方法参照GB/T 15038—2006[17]。

1.3.3 自由基清除活性的测定

1.3.3.1 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基清除活性参考Mitić等[18]的方法，稍作修改后进行测定。吸取0.1 mL 10倍稀释后的酒样，加到3.9 mL 25 mg/L的DPPH/乙醇溶液中，漩涡混合均匀，避光条件下反应20 min后，于515 nm处测定反应液吸光度。每个样品做3次平行试验。以15%的乙醇溶液代替酒样作为对照。DPPH自由基清除能力根据Trolox标准曲线以TEAC当量（Tro1ox equivalent antioxidant capacity，TEAC）表示。

1.3.3.2 ABTS+自由基清除活性

ABTS+自由基清除活性参考Wang等[19]的方法，稍作修改后进行测定。吸取0.1 mL 10倍稀释后的酒样，加到3.9 mL ABTS+工作溶液[2.45 mmol/L K2(SO4)2溶液与7 mmol/L ABTS溶液等体积混合，黑暗中反应12～16 h；稀释至在734 nm处吸光度为0.7±0.02]中，漩涡混合均匀，避光条件下反应8 min后，于734 nm处测定反应液吸光度。每个样品做3次平行试验。以15%的乙醇溶液代替酒样作为对照。ABTS+自由基清除能力根据Trolox标准曲线以TEAC当量（Tro1ox equivalent antioxidant capacity，TEAC）表示。

1.3.4 总酚含量的测定

总酚含量的测定参考Wang等[19]的方法，稍作修改后进行测定。吸取1 mL 10倍稀释后的酒样，加入5 mL去离子水，漩涡混合均匀，加入0.1 mL 1 mol/L的FC试剂，混合均匀；1 min后加入3 mL质量分数为7.5%的Na2CO3溶液，最后加入0.9 mL去离子水，漩涡振荡混合均匀后，于75 ℃恒温振荡水槽中水浴加热反应10 min。于765 nm处测定反应液吸光度。每个样品做3次平行试验。以15%的乙醇溶液代替酒样作为对照。总酚含量结果根据没食子酸标准曲线以GAE当量（Gallic acid equivalent，没食子酸当量）表示。

1.3.5 HPLC-DAD测定单体酚组成

色谱条件：参考Mitić等[18]的方法，稍作修改。

色谱柱：Agilent HC-C18柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）；柱温，30 ℃；进样量，10 μL；检测波长，320 nm；流速，0.8 mL/min。

流动相A，1%磷酸水溶液；流动相B，乙腈。洗脱程序：0～2 min，流动相A 90%～70%，2～8 min，流动相A 70%～35%，8～14 min，流动相A 35%～5%，14～18 min，流动相A 5%～35%，18～20 min，流动相A 35%～90%，20～22 min，流动相A/流动相B为90︰10。

标准溶液的制备：配制质量浓度均为120 mg/L的没食子酸、咖啡酸、阿魏酸、香豆酸、槲皮素混合标准溶液，并稀释成不同的浓度梯度。

酒样单体酚测定：参考Šeruga等[20]的方法，稍作修改。样品测定前用0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.4 数据统计与分析

所有试验结果表示为平均值±标准偏差（SD）。采用SPSS 19.0（IBM，Armonk，NY，USA）软件进行酒样自由基清除活性与总酚含量的相关性分析（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 主要理化指标

银杏葡萄酒的主要理化指标测定结果见表1。结果表明，银杏葡萄酒和对照葡萄酒的酒精度、总糖、总酸、挥发酸和游离二氧化硫等指标均符合葡萄酒国家标准GB 15038—2006。

表1 理化指标分析结果

2.2 自由基清除活性

2.2.1 DPPH自由基清除活性

Trolox标准曲线的标准方程为y=0.685 1-0.000 587 5x，标准曲线的相关系数R2=0.996 1，表明曲线具有较好的相关性。

银杏葡萄酒的DPPH自由基清除能力见图1。对照葡萄酒DPPH自由基清除能力相当于694.39 μmol/L Trolox当量，而银杏酶解液的加入对葡萄酒的DPPH自由基清除能力有明显的提高作用。其中，当酶解液添加量为20%时，提高得最多（提高263.51 μmol/L），其DPPH自由基清除能力相当于957.9 μmol/L Trolox当量。而当酶解液添加量为30%时，其DPPH自由基清除能力相当于922.16 μmol/L Trolox当量，相对于对照组提高了227.77 μmol/L，仅次于20%添加量的银杏葡萄酒。

根据该试验结果，认为银杏酶解液的加入能提高葡萄酒DPPH自由基清除能力，从而具有较好的抗氧化、延缓衰老的作用。具有较好抗氧化效果的是银杏酶解液添加量为20%的银杏葡萄酒。

图1 银杏葡萄酒的DPPH自由基清除能力（以TEAC当量表示）

2.2.2 ABTS+自由基清除活性

Trolox标准曲线的标准方程为y=0.688 3-0.000 658 2x，标准曲线的相关系数R2=0.998 4，表明曲线具有较好的相关性。

银杏葡萄酒的ABTS+自由基清除能力见图2。对照葡萄酒ABTS+自由基清除能力相当于724.20 μmol/L Trolox当量，而银杏酶解液的加入对葡萄酒的ABTS+自由基清除能力有提高作用。其中，当酶解液添加量为20%和30%时，提高得最多，其ABTS+自由基清除能力分别相当于844.79和857.39 μmol/L Trolox当量。其次，其他添加量的银杏葡萄酒ABTS+自由基清除能力相对于对照葡萄酒均有不同程度的提高。

根据试验结果，认为银杏酶解液的加入能在不同程度上提高葡萄酒ABTS+自由基清除能力，从而具有较高的抗氧化活性。因此，具有较好抗氧化效果的是银杏酶解液添加量为20%和30%的银杏葡萄酒。

图2 银杏葡萄酒的ABTS自由基清除能力（以TEAC当量表示）

2.3 总酚含量

没食子酸标准曲线的标准方程为y=0.000 959 5x-0.003 55，标准曲线的相关系数R2=0.999 8，表明曲线具有较好的相关性。

银杏葡萄酒的总酚含量见图3。对照葡萄酒的总酚含量为1 193.71 mg/L，而银杏酶解液的加入对葡萄酒的总酚含量具有增加的作用。银杏葡萄酒的总酚含量变化范围为1 327.46～2 130.71 mg/L，其中，当酶解液添加量为20%时，葡萄酒总酚含量提高了937 mg/L，总酚含量达到2 130.71 mg/L。银杏葡萄酒的总酚含量由大到小依次为：20%添加量＞30%添加量＞40%添加量＞10%添加量＞50%添加量。

根据试验结果，认为银杏酶解液的加入能在不同程度上提高葡萄酒的总酚含量，且具有高总酚含量的是银杏酶解液添加量为20%的银杏葡萄酒。

图3 银杏葡萄酒的总酚含量（以GAE当量表示）

2.4 单体酚测定

以峰面积为横坐标x，标准溶液的浓度为纵坐标y，得到每个单体酚的回归方程，结果见表2。没食子酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸和槲皮素5种单体酚标准品的质量浓度与相应的峰面积呈现良好的线性关系。

表2 多酚物质保留时间和回归方程

根据前述色谱条件检测对照组葡萄酒和银杏葡萄酒中5种单体酚含量，结果见表3。由表3可知，在对照组葡萄酒和银杏葡萄酒中均检测到了上述5种单体酚，且没食子酸含量最高。随着银杏酶解液添加量的增加，5种单体酚的含量均呈现减少的趋势，这是由于银杏果中含有的酚类物质主要是烷基酚类化合物，包括白果酚、白果二酚等，而上述5种单体酚的含量较少。因此，随着银杏酶解液的添加量的增加，没食子酸等5种单体酚的含量呈现逐渐下降的趋势。

表3 葡萄酒中单体酚含量的测定 mg/L

2.5 总酚含量与自由基清除活性的相关性分析

试验结果表明，银杏葡萄酒的DPPH、ABTS自由基清除活性与总酚含量的变化趋势具有一定的一致性。由图4可知，总酚含量与自由基清除活性呈现出一定的相关性，拟合线性回归方程分别为y=0.262 6x+406.965 1和y=0.134 6x+571.375 9，且皮尔逊相关性系数分别为0.72和0.74。由此说明银杏葡萄酒的总酚含量与自由基清除能力具有较好的相关性，且酚类化合物是抗氧化活性的主要贡献者，当酚类化合物的羟基数目增多，其抗氧化活性就越强[21]。

Linda等[22]研究了巴西蜂蜜及其提取物酚类物质以及抗氧化活性。结果表明：酚类物质是影响蜂蜜抗氧化活性的主要组分，表明其总酚含量和抗氧化活性可以用来评估蜂蜜的品质。Burns等[23]研究了红葡萄酒抗氧化活性与总酚含量之间的关系。结果表明：总酚含量越高，其抗氧化活性越强，表明不同多酚含量的葡萄酒可以产生不同程度的抗氧化活性，红葡萄酒可以为消费者提供更多对于健康有益的可能性。除此之外，许多学者研究表明：抗氧化活性与总酚含量之间具有不同程度的相关性[24-25]。

图4 总酚含量与抗氧化活性的相关性

3 讨论与结论

多酚类物质是葡萄、葡萄酒等物质中含有的一类主要的抗氧化活性成分，而其起到抗氧化活性的成分主要来源于黄酮类以及酚酸类物质[26]。目前大量研究表明：膳食摄入适量的植物生物活性物质与降低心血管疾病的风险之间具有强有力的联系。尤其是膳食摄入黄酮及酚类物质对于冠状动脉疾病和心肌梗死的发病率之间呈现一定的相关性[27]。试验采用DPPH、ABTS自由基清除能力探讨银杏葡萄酒的抗氧化活性。结果表明：银杏葡萄酒的总酚含量变化范围介于1 588.76～2 130.71 mg/L之间，平均含量为1 693.68 mg/L。银杏葡萄酒总酚含量与DPPH自由基清除能力相关性较好（R2=0.72，p=0.02），与此同时银杏葡萄酒总酚含量与ABTS自由基清除能力相关性较好（R2=0.74，p=0.01），表明银杏葡萄酒中多酚类物质与其抗氧化活性之间的关系密切，说明酚类物质是银杏葡萄酒发挥抗氧化活性的一个重要因素。综上所述，银杏葡萄酒总酚含量高于对照葡萄酒，且其总酚含量与清除自由基能力呈现出较好的相关性。