宣恩火腿粗肽液提取条件优化

邱朝坤，范露，刘家祺

武汉设计工程学院食品与生物科技学院（武汉 430205）

近年来，随着新兴提取技术的不断完善和科研技术的提升，对天然活性肽的研究日渐深入[1]。天然活性肽具有显著的生理功能，如神经调节、激素作用、免疫调节、抗血栓、抗高血压、降胆固醇、抑菌、抗病毒、抗癌、抗氧化作用等，被誉为“21世纪人类健康的新宠儿”[2-3]。肽对食品滋味有重要作用[4]，各种肽呈味肽因肽链长度、氨基酸组成、氨基酸序列、空间结构的不同而呈现出不同的呈味特性[5]。肽还可与食品中其他风味物质相互作用，明显改变原有风味[6]。

宣恩火腿是中国湖北省恩施自治州一带的特产，尤其以宣恩县所产火腿最负盛名，在清代乾隆时期就作为贡品进贡朝廷。宣恩火腿具有肉质细嫩、皮黄脂白肉红、气味鲜香宜人、滋味浓郁等特点[7]。火腿中的蛋白质在内源酶和外源酶的作用下分解成多肽、二肽等，而二肽的感官特性跟组成氨基酸有十分密切关联，对其味感有重要作用[8]。试验以宣恩火腿为研究对象，利用磷酸盐提取火腿中的粗肽液，为后续研究宣恩火腿蛋白质降解规律、多肽生理活性等提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

火腿（湖北省思乐牧业集团有限公司）。

所用试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

MS 104 S型分析天平（瑞士梅特勒）；LR-（5-10）型均质机（无锡意凯自动化技术有限公司）；722型可见分光光度计（天津市普瑞斯仪器有限公司）；TDL-5 A型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

剔除不可食用的火腿表面氧化层（约5 mm），油头（指火腿最下方部分约3 cm）以及肥膘部分，取火腿块约500 g，切碎，用绞肉机搅碎后搅拌均匀，装入密封袋中备用，4 ℃存放

1.3.2 粗肽液提取

样品多肽提取方法参照胡亚亚等[9]的方法进行，具体试验步骤为：称取25 g样品于均质机中，加入100 mL pH 7.0磷酸盐缓冲液（4 ℃）匀浆2 min，匀浆液于4 ℃，以12 000 r/min离心20 min，取上清液加入3倍体积40%乙醇，4 ℃放置12 h后再次离心（4 ℃，12 000 r/min，20 min），所得上清液用1 mol/L氢氧化钠调节至pH 7.0，即得宣恩火腿粗肽液。

1.3.3 粗肽液测定

肽含量测定方法参照方细娟的方法进行[10]，具体试验步骤为：准确吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 2.5 mg/mL牛血清蛋白标准溶液于10 mL比色管中，用水补齐至1.0 mL，加入5.0 mL福林酚试剂，立即混匀，室温下放置30 min，在650 nm处比色测定吸光度。以牛血清蛋白质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。取1 mL宣恩火腿粗肽液，按照标准曲线测定步骤测定吸光度，根据标准曲线计算样品多肽含量。

1.3.4 样品质量（g）与缓冲液体积（mL）比单因素试验

控制乙醇体积分数为40%，匀浆液与乙醇体积比1︰3，缓冲液pH 7条件下，分别研究样品质量与缓冲液体积比为15︰100，20︰100，25︰100，30︰100和

35 ︰100 g/mL时，宣恩火腿中粗肽含量。

1.3.5 乙醇体积分数单因素试验

控制样品质量与缓冲液体积比25︰100 g/mL，匀浆液与乙醇体积比1︰3，缓冲液pH 7条件下，分别研究乙醇体积分数20%，30%，40%，50%和60%时，宣恩火腿中粗肽含量。

1.3.6 缓冲液pH单因素试验

控制乙醇体积分数40%，匀浆液与乙醇体积比1︰3，样品质量与缓冲液体积比25︰100 g/mL条件下，分别研究缓冲液pH为5，6，7，8和9时，宣恩火腿中粗肽含量。

1.3.7 匀浆液体积与乙醇体积比单因素试验

控制乙醇体积分数40%，样品质量与缓冲液体积比为25︰100 g/mL，缓冲液pH 7条件下，分别研究匀浆液体积与乙醇体积比为1︰1，1︰2，1︰3，1︰4和1︰5时，宣恩火腿中粗肽含量。

1.3.8 正交试验

在单因素试验的基础上，选择样品质量与缓冲液体积比、缓冲液pH、乙醇体积分数、匀浆液与乙醇体积比4个因素，以宣恩火腿中粗肽含量为指标，设计4因素3水平正交试验，对提取条件进行优化。

2 结果与分析

2.1 样品质量与缓冲液体积比单因素试验结果

宣恩火腿中的肽主要来源于蛋白质的降解，大部分属于水溶性或能用低浓度盐溶液溶解，采用缓冲盐提取火腿中的肽，缓冲液体积对提取效果具有重要影响，体积过少，肉基质无法分散，肽提取不充分，体积过大，样品均质匀浆效果可能变差导致提取到的肽反而变少。从图1可以看出，样品中多肽含量随着溶剂用量的增大呈先上升后下降趋势，样品质量与缓冲液体积比20︰100 g/mL时提取到的多肽含量最高，为2.35 g/100 g，因而选取15︰100，20︰100和25︰100 g/mL这3个水平进行后续正交试验。

2.2 乙醇体积分数单因素试验结果

粗肽提取液仍然以蛋白质为主体物质，因此采用乙醇来沉淀蛋白并离心去除，故而选择恰当的乙醇体积分数显得尤为重要，乙醇体积分数过低，达不到沉淀蛋白的效果，乙醇体积分数过高，蛋白质和多肽溶解度都会下降。从图2可以看出，随着乙醇体积分数增加，提取的多肽含量逐渐下降，但乙醇体积分数20%时，多肽含量达2.94 g/100 g，明显高于其他水平（包括高于其他单因素试验里多肽含量），可能是蛋白质没有沉淀完全，而福林酚试剂也会与之反应，导致测定结果偏高。综合考虑，选择乙醇体积分数为30%，40%和50%进行后续正交试验。

图1 样品质量与缓冲液体积比对粗肽液提取效果的影响

图2 乙醇体积分数对粗肽液提取效果的影响

2.3 缓冲液pH单因素试验结果

由于受多肽骨架在中氨基酸侧链的影响，多肽溶解性与提取液pH有较大关联度，忽晓平等[11]对金华火腿多肽的提取研究结果表明，采用磷酸盐缓冲液做提取剂时，强酸性环境、中性偏碱性环境有利于金华火腿中多肽的提取。磷酸盐缓冲液的pH 2或pH 7.0～9.0时，提取率较高。从图3可以看出，宣恩火腿多肽在中性偏碱条件下溶解度更高，因而选择缓冲液pH 7.0，8.0和9.0进行后续正交试验。

2.4 匀浆液体积与乙醇体积比单因素试验结果

乙醇体积对提取效果的影响与乙醇体积分数相对应，从图4可以看出，匀浆液与乙醇体积比1︰3时能够提取到的多肽含量最大，综合考虑，选择匀浆液体积与乙醇体积比1︰1，1︰2和1︰3进行后续正交试验。

图3 缓冲液pH对粗肽液提取效果的影响

图4 匀浆液体积与乙醇体积比对粗肽液提取效果的影响

2.5 正交试验

根据单因素试验结果进行四因素三水平正交试验，试验因素水平表见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验设计表

表2 正交试验结果

对正交试验进行极差分析，得出宣恩火腿中粗肽液提取的最佳工艺条件为A1B2C1D3，即样品质量与缓冲液体积比15︰100 g/mL，乙醇体积分数40%，缓冲液pH 7.0，匀浆液与乙醇体积比1︰3。4个因素对宣恩火腿中粗肽液的提取效果影响性存在差别，其重要性依次为C＞B＞A＞D，即缓冲液pH＞乙醇体积分数＞样品质量与缓冲液体积比＞匀浆液体积与乙醇体积比，因此在对宣恩火腿中的粗肽液的提取时，应严格控制缓冲液pH以保证宣恩火腿中粗肽液较高的提取率。

由于A1B2C1D3在正交表中并未出现，正交表中最高组合为A3B2C1D3，因而在上述2组组合中进行验证试验，结果见表3。

由表3可知，2种条件下提取的粗肽含量差异不大，2种条件下差别仅在缓冲液用量，而在单因素试验中当。样品质量与缓冲液体积比15︰100和25︰100 g/mL时提取的粗肽含量也比较接近，从节约试剂角度考虑，选取样品质量与缓冲液体积比15︰100 g/mL。

表3 验证试验

3 结论

以中国四大名腿之一的宣恩火腿为对象，研究其多肽的提取条件，通过单因素试验和正交试验对影响宣恩火腿中粗肽液提取效果的样品质量与缓冲液体积比、乙醇体积分数、缓冲液pH、匀浆液与乙醇体积比进行优化，结果表明，宣恩火腿多肽最佳提取条件为：样品质量与缓冲液体积比15︰100 g/mL，乙醇体积分数40%，缓冲液pH 7.0，匀浆液与乙醇体积比1︰3。在此条件下能最大限度提取出宣恩火腿中的多肽，为后续研究宣恩火腿蛋白质降解规律、多肽生理活性等提供参考。